PCR技术在食品微生物检测中的应用

2022-12-06周振杰

现代食品 2022年11期

◎ 周振杰

（甘肃省庄浪县市场监督管理局（甘肃省庄浪县食品药品稽查局）,甘肃庄浪 744699）

在食品微生物检测工作中采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术时，应形成正确的技术应用认知，制定完善的技术方案，通过有效的措施提高食品微生物检测工作的效率，发挥现代化技术的作用，确保能及时发现食品微生物问题，并有效解决和应对，为保证食品质量、维护人们的身体健康和生命安全夯实基础。

1 PCR技术在食品微生物检测中的应用

1.1 大肠杆菌的准确检测

传统的食品微生物检测技术能对大肠杆菌进行检测，但检测范围狭窄，而采用PCR技术能在检测常规大肠杆菌的基础上，准确检测出引起人们肠出血的大肠杆菌类别，为食品质量和安全管理提供一定的保障。

1.2 沙门氏菌的有效检测

沙门氏菌具有一定的传染性，且对人体的危害非常严重，甚至有致死性的危害，因此对其进行有效检测非常重要。而多重类型的PCR技术在应用过程中，可确保检测结果的精确度和精准性，增强整体检测工作的有效性和可靠性。

1.3 非致病菌的合理检测

非致病菌主要涉及乳酸菌，是在自然界广泛存在且具有一定学术研究价值的菌类，与人们的日常生活、生产、食品和医疗等有密切关联。采用PCR技术开展乳酸菌的检测工作，不仅能准确归纳分析其具体规律，还能提升整体检测工作的效率和效果。

此外，在食品检测过程中采用先进的PCR技术，还能提升各项检测工作的便利性、改善目前的工作现状、增强检测工作的精确性和科学性，在满足卫生检测工作标准的同时，还能促使食品安全管理工作的有效落实和全面开展。

2 PCR技术分析

2.1 常规PCR技术

常规的PCR技术在实际应用的过程中，主要是设置DNA模板和引物，制备缓冲液材料和MgCl2溶液，将各类材料有机整合成为反应混合物，通过热稳定DNA聚合酶进行催化处理，对寡核苷酸引物界定出来的DNA片段进行扩增处理。此类扩增操作是将模板DNA作为基础部分，进行引物的变性反应、退火反应和延伸反应。在循环操作的情况下，使目标DNA片段出现扩增的现象。通常情况下，各个反应周期出现的DNA片段都可作为下个循环的模板，所以PCR技术在应用期间所产生的产物是以指数形式增加。例如，在食品微生物检测过程中使用常规PCR技术，可有效检测沙门氏菌，按照沙门氏菌基因设置引物，可有效检测沙门氏菌、多种血清型与菌属的非沙门氏菌，检测的准确性较高。

2.2 多重PCR技术

多重PCR技术在实际应用过程中和常规技术的应用原理相同，不同之处是在相同反应体系内设置一对或以上的特异类型引物，构建和各个引物特异性进行互补的模板，即可在相同反应管内扩增多条目标DNA片段。此技术不仅能保留常规技术的特异性和敏感性优势，还能简化检测工作的步骤、减少试剂的使用剂量、一次性同时扩增多种需要检测的微生物，因此在食品微生物检测期间采用多重PCR技术，能同时检测多种微生物基因，减少工作人员的工作量。但是，多重PCR技术在应用过程中存在不足之处，如扩增处理的效率较低、缺乏一定的敏感性。在扩增过程中需要摸索反应条件，可能会发生不同引物之间相互干扰的问题，因此需要结合具体情况探索多重PCR技术的应用措施和方法。例如，在食品中大肠菌群的检测过程中采用多重PCR技术，可利用点对点的方式设置固定性多聚dT尾捕捉探针，配合使用生物素进行扩增DNA标记处理，达到准确检测食品微生物的目的。

2.3 RT-PCR技术

逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技术的原理是提取食品组织，或提取食品细胞内的总RNA，将其中所存在的mRNA作为模板，利用dT或随机引物，借助逆转录酶将提取的物质转录成为cDNA，再将其作为模板实现PCR扩增的目的，明确目标检测基因的情况。在食品微生物检测过程中采用此技术能提升RNA检测的灵敏度，甚至能提升多个数量级，准确分析微量RNA样本。例如，在食品微生物检测的过程中可通过RTPCR技术进行大肠杆菌噬菌体的检测分析，将F-RNA平板作为阳性结果数据值的依据，在SC（Somatic Coliphage）噬菌体和F-RNA（F-specific RNA）噬菌体混合液内，可准确、有效检测F-RNA噬菌体[1]。

2.4 免疫PCR技术

免疫PCR技术是将DNA分子作为主要标记物，在进行一般免疫反应的基础上，还可有效完成PCR扩增操作、电泳分析操作，整体的免疫试验效果较高。在食品微生物检测过程中采用免疫PCR技术，可提升系统的扩增性能，改善抗原抗体反应的特异性，最大程度地增强检测抗原应用的灵敏度，且由于所有DNA分子都属于可选择性的固定分子，合成一对引物即可完成操作，可避免在更换检测对象过程中还需更换引物的问题，简化了操作流程和操作模式。免疫PCR检测技术的应用，通常可将生物素当作连接分子，而生物素在应用过程中具备独立性的结合点位，其中一个点位能和DNA分子结合，另外一个点位能和抗原-抗体复合物中的亲和素之间相互结合，使DNA分子与抗原-抗体亲和素相互整合，最终生成抗原、抗体、亲和素、生物素和DNA之间相互融合的复合物，再进行PCR扩增处理，对DNA进行合理地标记即可。

2.5 巢式PCR技术

巢式PCR技术需构建两套引物达到PCR扩增处理的目的，通过内部和外部两对引物前后进行靶基因片段的扩增处理，先使用其中一套引物扩增20个左右的循环，再利用已经完成扩增的DNA片段，进入另外一套引物的扩增循环，循环20个左右。在此期间第二套引物的设计片段位置是在第一套引物的扩增片段内，因此可将第一套引物称作外引物，第二套引物称作内引物。此外，巢式PCR技术的应用不仅能提升整体反应的特异性，还能获得非常丰富的特异靶序列，提高整体检测的敏感度，在食品微生物检测的过程中，能有效进行基因靶DNA的单拷贝扩增处理，提升整体检测效率和准确性[2]。

采用巢式PCR技术可在首次扩增反应完成后开启反应管，去除前一套引物，再设置另一套引物，整个操作流程较为烦琐，很容易出现反应系统污染的问题，所以目前部分技术人员在食品微生物检测过程中对巢式PCR技术进行了改进，通过引物的改进使外引物退火温度比内引物高，从最开始的反应阶段就将两套引物同时设置在反应系统内，外引物在退火温度的影响下形成双温循环扩增，而内引物不能和模板之间形成较为稳定的双链，所以不会起到相应的作用。在外引物扩增反应完成后，再设置低火温的循环处理，在退火温度较低的情况下，内引物开始发生反应，多次循环逐渐减小变性温度，这样能预防在整体反应过程中PCR最开始的循环出现原始样本模板序列产物解链的问题，以免内引物成为外引物的模板，增强检测效果的同时弥补了常规技术的不足，提升食品微生物检测工作的质量和水平[3]。

3 PCR技术在食品微生物检测中应用的基础保障

3.1 合理选择仪器设备

在进行食品微生物检测前，应结合PCR技术的应用特点和情况，科学选择仪器设备，确保所选用的仪器设备可进行食品微生物的快速检测，精确检验菌落的总体数量，精确度控制在合理范围内，重复性维持在5%以内，同时还需结合食品的特点进行检测仪器设备的选择。例如，牛奶、面包、豆浆和果汁等可采用微生物分子检测仪设备；食品中的沙门氏菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌等检测可采用多孔板仪器设备进行多次试验分析。同时，在应用该技术过程中还可构建多重串联类型的实时性荧光定量检测设备，如联合使用试验试剂盒、冰箱、灭菌器、梯度仪和核酸电泳仪等，并且在全封闭的环境下检测，避免发生检测结果假阳性或假阴性的问题，提升整体检测分析的精确度[4]。

3.2 合理选择试验方法

食品微生物检测的过程中采用PCR技术，应重点选择合理的试验检测的方法，确保检测工作的有效开展。例如，采用PCR技术检测肉制品中的微生物，可分为以下步骤。①取食品样本，放入蒸馏水中，加热搅拌后使样本溶解，再在高温、高压的环境中进行灭菌。②使用灭菌纯水稀释试验材料，放置在规定的温度环境中保存，将硼酸等物质放置在蒸馏水内，调整pH值，确保pH值在稳定的范围内，然后在高压灭菌室内存储。③制作琼脂糖凝胶。称取数量符合规定标准的琼脂糖，加入反应材料，通过微波炉加热处理，等待所有琼脂糖溶解后，注入模具内进行冷却。再称取一定数量的琼脂糖，在蒸馏水中溶解，严格控制蒸馏水的含量，放置在高温环境中进行灭菌处理，灭菌操作时间符合标准规范。④构建完善的PCR检测体系，对检测靶基因扩增处理，将需要检测的目标菌种制作成模板，混合溶液内存在的多种菌种，形成多重性的PCR反应程序和体系，结合检测结果进行标准曲线的绘制，获得相应的扩增效率指标。再按照稀释倍数的特点和情况，明确菌落计算数据结果，每隔一段时间完成三重PCR检测的任务，如果变异系数能维持在合理范围内，则证明使用的检测措施具备较高的重复性和精确性，能满足标准要求[5]。

在牛奶中沙门氏菌含量的测定过程中，采用PCR模板制备技术开展灵敏度试验，检测样本中沙门氏菌的敏感性情况。①合理选择样本，科学开展纯菌培养操作，将牛奶食品样本放入高压蒸汽灭菌器内经过处理后，存储在冰箱内。②对所有试验菌株进行接种处理，在液体内接种，通过振荡方式进行液体内菌种的培养，培养温度和振荡速度控制在规定范围内。③采用乙醇沉淀技术进行模板的制备，提取细菌培养液放置在离心机设备中离心处理，合理控制设备转速，再使用灭菌蒸馏水进行洗涤，通过悬浮液缓冲，在相应的环境中离心处理，隔水煮沸后加入醋酸钠物质，添加无水乙醇，离心处理后添加缓冲剂进行复溶，通过乙醇洗涤，放置在冰箱内冷却，完成模板的制作。④将浓度适中的菌液接种在试验样本内，提取基因组，扩增后绘制扩增数据值的表格和图片，根据标准曲线进行样本中的微生物检测，明确大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等检测下限是否符合规定标准要求，如果符合规定就代表食品中微生物含量合格，如果超出规定标准就代表食品中所含微生物超标，存在质量安全问题。