靳子尧，张学梅

（1.桂林医学院基础医学院，广西 桂林 541199；2.桂林医学院附属医院病理科，广西 桂林 541001）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占全球恶性肿瘤死亡率第4 位，在发达国家的发病率最高[1]。我国结直肠癌年均新发病例达19 万，发病率和死亡率均为恶性肿瘤第5 位[2]。目前，结直肠癌正逐渐倾向年轻化[3]。结直肠癌发病因素复杂多样，潜在的危险因素包括高脂饮食、肥胖、运动缺乏和微生物感染等。长期暴露于上述危险因素会影响肠道微生物群和宿主免疫，导致结直肠上皮细胞的遗传和表观遗传改变，最终诱发结直肠癌[1，3]。近年来，有关N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）在结直肠癌的作用及分子机制研究逐渐深入，其有望为结直肠癌诊治提供新的方向。本文主要综述METTL3 和METTL14 在结直肠癌增殖、凋亡、侵袭转移以及耐药中的作用。

1 m6A 甲基化修饰

m6A 甲基化修饰是常见的RNA 甲基化修饰，发生在腺嘌呤第6 位N 原子。它是一种动态可逆性的转录后修饰，在mRNA 和非编码RNA 中最为丰富。m6A 修饰主要发生在RRACH 序列（其中R=A或G，H=A，C，或U），并且在mRNA 3’-UTR 和CDS区富集明显[4-6]。m6A 参与了RNA 代谢的多个过程，如转录后剪接、翻译效率及稳定性维持，在生长发育、学习记忆等正常生理过程中必不可少[7，8]，并且在调控机体热休克反应甚至是肿瘤发生发展以及肿瘤免疫耐药等各方面都至关重要[9-11]。

m6A 修饰发生在RNA 转录后水平，受甲基转移酶、去甲基化酶以及甲基识别蛋白共同调控。其中甲基转移酶催化RNA 上的腺苷酸发生m6A 修饰，它是由METTL3（methyltransferase like 3）、METTL14（methyltransferase like 14）、WTAP（Wilms’tumor 1-associating protein）和KIAA1429 等多种蛋白亚基构成的复合物[12，13]。去甲基化酶的核心蛋白包括FTO（fat mass and obesity-associated protein）和ALKBH5（AlkB homolog 5），可以对发生m6A 修饰的碱基进行去甲基化修饰，这也是甲基化动态可逆性的根本原因。甲基化识别蛋白则能够识别和结合发生m6A修饰的碱基，调控RNA 降解与稳定、出核转运以及翻译效率等过程。鉴于它们的功能特点，这些蛋白被形象的称为“书写者（writer）”“擦除者（eraser）”“阅读者（reader）”[14]。

研究表明[15，16]，在甲基转移酶复合物中，METTL3主要作为催化亚基，而METTL14 则作为靶点识别区域在RNA 结合以及复合物稳定等方面发挥作用。WTAP 作为调节亚基与METTL3/14 复合物相互作用，使其定位到富含pre-mRNA 加工因子的核斑点，并催化甲基转移酶的活性[17]。此外，已知的甲基转 移 酶 还 包 括VIRMA（KIAA1429）、METTL16、RBM15/15B 和ZC3H13 等[14]。

研究发现[18]，FTO 作为去甲基化酶可调节细胞内源性m6A 残基水平，揭示了m6A 在mRNA 中的修饰是动态可逆的调控过程。这一发现是揭开m6A甲基化修饰真实面目的关键环节。另一个去甲基化酶ALKBH5 与FTO 同属于ALKB 双加氧酶家族，与核斑点共定位，其发挥功能作用依赖Fe（Ⅱ）和2-氧戊二酸加氧酶[19]。经典的甲基识别蛋白包含YT521-B 同源（YT521-B homologous，YTH）结构域蛋白（包括YTHDF1-3，YTHDC1 和YTHDC2）[20,21]、人胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白家族（包括IGF2BP1-3）[22]、核不均一核糖核蛋白（包括hnRNP A2/B1 和hnRNP C）[23]和eIF3 等。近年来的研究显示[24-26]，m6A 修饰相关的writer、eraser、reader 蛋白在结直肠癌发生发展过程中起着重要作用，其精细的调控机制已逐渐成为新的研究热点。

2 m6A writer 蛋白METTL3 促进结直肠癌的发生与发展

研究发现[27-30]，结直肠癌患者肿瘤组织中METTL3表达增加，其表达越高患者预后越差。METTL3 在转录后水平调节多种癌基因和抑癌基因的表达发挥促结直肠癌的增殖作用。过表达METTL3 会抑制SOCS2 并促进LGR5 启动子活性，以维持结肠癌细胞的细胞增殖[27]。敲除METTL3 显著抑制了结直肠癌细胞的增殖和迁移。研究表明[31]，METTL3 靶向YPEL5 m6A 修饰位点以抑制其表达，促进结直肠癌肿瘤的生长和转移。另一方面，METTL3 通过甲基化CCNE1 mRNA 3'-UTR 的m6A 位点来稳定其表达水平，以提高cyclin E1 蛋白表达从而促进结直肠癌细胞增殖[32]。此外，METTL3 通过m6A/IGF2BP2 依赖的方式促进PTTG3P 的表达，调控PTTG3P/YAP1 轴从而诱导结肠癌细胞增殖，促进结肠癌的进展[33]。

METTL3 还可通过影响肿瘤细胞代谢来调控结直肠癌的进展。研究证实[29]，METTL3 对GLUT1 mRNA 进行m6A 修饰，以提高其mRNA 的稳定性和翻译水平，促进葡萄糖代谢和结直肠癌的发生。通过对m6A-GLUT1-mTORC1 轴的调控，METTL3积极的参与了结直肠癌的发生发展，而同时抑制mTORC1 和METTL3 会对结直肠癌的治疗具有累加效应。Shen C 等[34]研究发现，葡萄糖摄取量高的结直肠癌患者较摄取量低的患者其METTL3 表达水平明显增高。进一步研究证实，METTL3 与HK2 和SLC2A1（GLUT1）的3'UTR 结合，通过IGF2BP2/3 对甲基化位点的识别与结合作用使HK2 和SLC2A1（GLUT1）在结直肠癌中稳定表达，并激活了糖酵解途径。由此推测，靶向METTL3 可能通过影响肿瘤代谢功能从而成为治疗结直肠癌的潜在有效靶点。

METTL3 不仅作用于mRNA，还可以调控miRNA、LncRNA 和circRNA 的表达或受其调控，以介导结直肠癌的恶性进展。有研究发现，METTL3 通过介导pri-miR-1246 甲基化，促进pri-miR-1246 的成熟。而miR-1246 通过负向调控SPRED2 解除其对MAPK 信号通路的抑制，从而促进结肠癌的转移和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）[35]。Chen C 等[36]发现，circ1662 在结直肠癌中发挥癌基因的作用，通过增强YAP1 的核转运促进结直肠癌的侵袭和迁移。该实验结果表明，circ1662 通过YAP1 抑制SMAD3 的表达以促进EMT 的发生。需要说明的是，METTL3 可以诱导circ1662 发生m6A 修饰以稳定其表达，它是维持circ1662-YAP1-SMAD3 轴有序进展，诱发结直肠癌细胞侵袭、迁移和EMT 的关键因素。METTL3 介导HSF1 3'-UTR处的m6A 修饰可以由YTHDF2 识别并提高其翻译效率，促进结直肠癌细胞增殖。然而，miR455-3p 可与METTL3 竞争性结合HSF1 3'-UTR，而β-catenin可以抑制miR455-3p 的生成，以阻断miR455-3p 竞争性抑制METTL3 介导的m6A 修饰[37]。功能实验表明[38]，lncRNA LINC01605 与METTL3 结合并介导SPTBN2 mRNA 的m6A 修饰，从而促进SPTBN2 的翻译，致使结直肠癌细胞增殖和转移能力增强，细胞凋亡能力减弱。另有研究结果显示[39]，癌基因LINC00460 促进结直肠癌的增殖，这与它作用于IGF2BP2 和DHX9 并结合HMGA1 mRNA 的3'-UTR，从而增强HMGA1 mRNA 的稳定性和蛋白表达有关。实际上，METTL3 介导的m6A 修饰对LINC00460/IGF2BP2/DHX9-HMGA1 轴的调控发挥至关重要的作用。LINC00460 介导METTL3 对HMGA1 mRNA 的m6A 修饰以增强HMGA1 在结直肠癌中的表达，进而诱导结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。沉默METTL3 有效逆转了LINC00460 对HMGA1 表达的正向调控及促癌作用[39]。

总之，METTL3 以m6A 修饰的方式调控多种靶分子的表达和功能作用以影响结直肠癌细胞增殖、凋亡、代谢及侵袭转移能力。因此，特异性靶向METTL3 在结直肠癌治疗中具有重要的应用前景。

3 m6A writer 蛋白METTL14 抑制结直肠癌的进展

METTL14 在结直肠癌中的表达水平与METTL3相反，在结直肠癌中低表达。METTL14 表达越高患者总生存期越长，且过表达METTL14 能够抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭和转移[40，41]。研究证实[42]，敲除METTL14 能够降低其下游靶点SOX4 的m6A 修饰，导致YTHDF2 识别被修饰的SOX4 mRNA 作用减弱，因此提高了SOX4 的基因表达，促进了SOX4 介导的EMT 过程和PI3K/AKT 信号通路的活性，致使结直肠癌发生恶性进展。Wang S 等[43]发现，沉默METTL14 表达促进了结直肠癌细胞侵袭和迁移，而肿瘤转移相关基因MeCP2 对METTL14 的结合作用增强了其对KLF4 mRNA 的m6A 修饰，并通过IGF2BP2 识别该修饰位点使KLF4 mRNA 稳定性增强，表达水平增加，调节结直肠癌细胞的转移。METTL14 同样可以通过影响miRNA 和lncRNA 参与结直肠癌的发生和发展。研究发现[41]，METTL14促进primiR-375 发生m6A 修饰，并依赖DGCR8 促进premiR-375 的表达与成熟，而后表达增加的miR-375 分别靶向YAP1 和SP1 以抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭与转移。敲除METTL14 则降低了lncRNA XIST 的m6A 水平，减少了YTHDF2 对XIST 的识别和降解作用，促进了XIST 的表达和结直肠癌细胞的增殖和侵袭[44]。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor -associated macrophage，TAM）可以抑制T 细胞的抗肿瘤活性，但机制尚不明确。近期研究发现[45]，结直肠癌患者肿瘤组织中METTL14 的表达水平与CD8+T 细胞浸润呈负相关。TAM 亚群C1q+细胞中METTL14 的表达水平降低，可以促进结肠癌细胞生长并阻碍CD8+T细胞浸润。进一步发现，C1q+细胞中的Ebi3 表达水平降低可以恢复CD8+T 细胞的抗肿瘤杀伤能力，而METTL14 表达缺失可以降低C1q+细胞Ebi3 mRNA的m6A 修饰水平，并促进其转录水平增高。因此，提高TAM 亚群C1q+细胞中METTL14 的表达可以通过介导Ebi3 的m6A 修饰促进CD8+T 细胞的浸润和抗肿瘤作用[45]。

4 m6A writer 蛋白METTL3 和METTL14 参与结直肠癌耐药的发生

化疗、靶向治疗和免疫治疗显著改善了肿瘤患者的治疗状况。然而，在化疗过程中癌细胞获得耐药性是治疗面临的主要挑战，这极大的限制了癌症的治疗效果，严重影响患者的生存状况。研究显示[46]，Sec62 在化疗耐药的结直肠癌组织中高表达，并通过维持肿瘤细胞的干性诱导耐药。机制研究发现，Sec62 特异性结合β-catenin，通过抑制其泛素化降解以稳定β-catenin 从而活化Wnt 信号通路。更重要的是，METTL3 介导的Sec62 m6A 修饰是Sec62表达上调的关键环节。敲除METTL3 减少了Sec62 mRNA 的m6A 修饰及稳定性，同时也降低了Sec62 mRNA 和蛋白水平，进而维持了肿瘤细胞的干性，促进化疗耐药。这一过程依赖于识别蛋白IGF2BP1 结合和稳定m6A 修饰的Sec62 mRNA[46]。数据表明[47]，LBX2-AS1 能驱动结直肠癌细胞对5-FU 产生耐药，而METTL3 诱导lncRNA LBX2-AS1 发生m6A甲基化是LBX2-AS1 在结直肠癌中高表达的重要原因。METTL3 还可以通过介导CBX8 mRNA m6A修饰参与调节结直肠肿瘤干性和化疗敏感性。研究发现[48]，CBX8 能维持结直肠癌细胞的干性特征，并抑制结直肠癌细胞对抗肿瘤药奥沙利铂（L-OHP）和伊立替康（CPT-11）的敏感性。进一步的研究发现，CBX8 通过与KMT2b 和PolⅡ相互作用促进LGR5 的转录和表达，而诱导CBX8 异常表达增加的机制与METTL3 介导的m6A 修饰密切有关。在结直肠癌中敲除METTL3 的表达显著抑制了CBX8 mRNA m6A 甲基化水平，导致CBX8 mRNA 稳定性降低。结合RMBase 预测和RIP 分析可知，IGF2BP1 和CBX8 mRNA 相互作用，增强了CBX8 的稳定性并使其表达上调，最终诱导了结直肠癌细胞的耐药[48]。

此外，研究发现[49]，p53 R273H 突变的结肠癌细胞中m6A 甲基化水平升高，并且其与阿霉素耐药相关。进一步的研究提示，鞘糖脂Gb3 介导β-catenin信号通路可以上调METTL3，而METTL3 介导的m6A 修饰决定了p53 R273H 突变蛋白的表达水平及肿瘤耐药。过表达METTL3 促进了p53 pre-mRNAm6A 甲基化形成，增强了p53 R273H 突变蛋白的表达量，导致结直肠癌细胞对多种化疗药物耐药。反之，沉默METTL3 表达能恢复肿瘤细胞对治疗的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，从而改善肿瘤的治疗效果。该研究提示，抑制METTL3 介导的m6A-RNA 甲基化可能是靶向TP53 R273H 错义突变的一种特异而高效的方法。

近年研究显示[50]，肿瘤细胞耐药与肿瘤微环境中的TAM 密切相关。奥沙利铂作为治疗结直肠癌的一线化疗药物被广泛应用。研究发现，TAM 通过METTL3 介导的TRAF5 m6A 修饰促进结直肠癌对奥沙利铂的耐药。相比奥沙利铂敏感患者，耐药患者的结直肠癌组织中TAM 浸润明显增多，同时m6A修饰水平及METTL3 的表达量均增加。极化成M2型的TAM 通过增强METTL3 对TRAF5 的m6A 修饰促进其降解从而抑制了肿瘤坏死并激活了肿瘤细胞发生奥沙利铂耐药[51]。因此，靶向M2 型TAM 中的METTL3 可能是恢复结直肠癌患者对奥沙利铂敏感性的重要途径。

阻断程序性细胞死亡-1（programmed cell death receptor-1，PD-1）检查点的免疫治疗已在临床中取得了较好的疗效。然而，大部分结直肠癌患者对抗PD-1 抗体治疗耐药。原因在于超过4/5 的结直肠癌中无错配修复蛋白缺失或者低频微卫星不稳定，这类患者的肿瘤细胞突变负荷低，对免疫治疗的反应和效果不理想。Wang L 等[52]研究显示，沉默METTL3或METTL14 的表达能增强结直肠癌细胞对抗PD-1抗体治疗的敏感性，这与敲除METTL3 或METTL14的表达后促进CD8+T 在肿瘤中的浸润并增强其对肿瘤细胞的杀伤作用有关。机制分析证实，METTL3或METTL14 的缺失使Stat1 和Irf1 mRNA m6A 修饰减少，削弱了YTHDF2 对Stat1 和Irf1 mRNA 的降解作用，进而促进了Stat1 和Irf1 mRNA 的稳定和表达增加，诱导IFN-c-Stat1-Irf1 信号传导。因此，METTL3 或METTL14 缺失通过抑制m6A 修饰，增强无错配修复蛋白缺失或者低频微卫星不稳定性结直肠癌细胞对抗PD-1 抗体的治疗效果，可以作为抗癌免疫治疗耐药的潜在分子靶点。

METTL3 和METTL14 介导m6A 修饰通过多途径参与结直肠癌耐药的发生。对METTL3 和METTL14 驱动的耐药模式的深入了解可以促进新型靶向抗肿瘤药物的开发，以提高结直肠癌治疗的疗效。

5 总结与展望

迄今为止，针对结直肠癌的治疗方法仍然非常有限。基于高通量测序、蛋白质组学等实验技术的快速发展为深入研究m6A 修饰在结直肠癌中的机理作用提供了更多的可能性。METTL3 与METTL14形成异二聚体作为甲基转移酶复合物的支架发挥催化m6A 甲基化修饰的核心作用，调控了结直肠癌的增殖、凋亡、侵袭转移与耐药等多个生物学过程。但是m6A 修饰在结直肠癌中的分子机制作用仍然存在一些问题。例如METTL3 和METTL14 在结直肠癌增殖和侵袭转移方面的功能作用截然相反，如何针对两者设计和制定行之有效的靶点药物值得综合考虑。因此，需要明确在结直肠癌中两者发挥功能的主次关系以及两者之间如何相互调控；其次，影响结直肠癌发生发展的因素错综复杂，m6A 修饰是否影响肠道发育、肠上皮细胞的代谢和吸收，以及肠道菌群的变化等需要更多的研究进行证实。

总之，METTL3 与METTL14 作为靶点分子在结直肠癌治疗中具有重要作用，但对于其在结直肠癌症中的作用机制仍需要进一步探索。