王 悦，郑云曦，徐松松，向光明，李 华，王 楠，冯 政，李 奎，牟玉莲

(1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东省动物分子设计与精准育种重点实验室，佛山 528225；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3.南昌大学玛丽女王学院，南昌 330031；4.中国农业科学院农业基因组研究所，深圳 518120)

野生型p53诱导的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatasel,Wip1)又名蛋白磷酸酶Mg2+/Mn2+依赖性1D(protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1D,PPM1D)，是一种丝/苏氨酸磷酸酶，属于蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C,PP2C)家族。Wip1基因通过调控机体内一些重要信号分子，如p53、p38 MAPK、ATM、Chk1/2、MDM2等，影响细胞增殖、分化、衰老、凋亡、自噬以及DNA损伤修复等过程。此外，Wip1基因也在繁殖调控、免疫调节等方面发挥着重要作用。作者主要综述了Wip1基因对动物繁殖及免疫炎症的调节作用，以期为家畜育种、疾病防治及靶向治疗提供新思路。

1 Wip1基因的发现及结构特征

Fiscella等[1]研究发现，淋巴瘤细胞在紫外线照射下表达野生型p53基因诱导的蛋白，且该蛋白不仅表现出依赖于Mg2+的PP2C特征，而且依赖于野生型p53，即在细胞应激时p53靶向作用于其编码基因，因此命名为Wip1。作为PP2C家族中的一员，Wip1由PPM1D基因编码。Wip1基因位于人17号染色体、小鼠11号染色体、猪12号染色体上。Wip1基因在小鼠和猪中均有6个外显子，而在人中有7个外显子。小鼠与人Wip1蛋白总体相似性为83%，与人、果蝇等其他PP2C序列也有很高的相似性，且在物种之间有几个明显的保守区，特别是在基因的中心区域，表明PP2C家族在进化上具有保守性[2-3]。人Wip1蛋白结构包含2个主要结构域，即第1―375位氨基酸为高度保守的N-端磷酸酶结构域，第376―605位氨基酸为不太保守的非催化结构域[4]。Wip1蛋白N-端能够靶向识别p(S/T)Q序列中的丝氨酸、苏氨酸等[5-6]，是发挥去磷酸化功能的位点。

2 Wip1基因的生物学功能

为了抵御基因组如错配、单链和双链断裂等DNA损伤威胁，细胞进化出DNA损伤反应机制来维持基因组完整性。Wip1通过去磷酸化DNA损伤反应蛋白，即p53、ATM、Chk2、MDM2、p38 MAPK等，来抑制应激反应，终止DNA损伤。因此，Wip1可以消除细胞周期检查点，抑制衰老、凋亡、DNA修复和炎性细胞因子的产生[7-9]。Wip1基因能通过调控细胞周期在神经系统中产生影响，还可通过抑制p53的活性阻碍G2/M细胞周期的进行，从而减少细胞的生成，维持了中枢神经系统稳态，在成年神经干细胞(adult neural stem/progenitor cells,NPCs)中的研究也表现出同样的结果[10]。Wip1基因会阻碍染色体复合体向中心纺锤体迁移过程，从而抑制细胞有丝分裂的发生，使细胞增殖速度减缓[11-12]。Wip1基因能够调控小鼠胚胎中造血干细胞的增殖发育，其调节机制可能是由mTORC1信号通路所致[13-14]。在急性髓系白血病细胞中也有类似的研究，如应用小RNA干扰技术抑制Wip1基因后，表现为细胞增殖被抑制，同时细胞凋亡被促进，p38 MAPK/p53信号通路被激活[15]。Wip1基因沉默可促进妥唑胺诱导的细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞周期停滞[16]。双链DNA断裂在G2阶段激活DNA损伤检查点以触发细胞周期停滞，G2期间细胞受损会永久退出细胞周期，进入衰老或凋亡。Wip1基因缺失会导致G2期p53的异常高活化和同源重组缺陷，这两者都会导致DNA修复受阻和细胞衰老[17-19]，Wip1基因敲除小鼠的造血干细胞表现出衰老表型[13]。He等[20]构建Wip1基因敲除小鼠模型发现，Wip1基因敲除会使γH2AX去磷酸化进而促进海马细胞衰老，从而导致Wip1基因敲除小鼠抑郁。miR-16与p53和Wip1基因的信号通路反馈环也可调节细胞凋亡和衰老[21]。另外，Wip1基因可通过STING/TBK1/IRF3信号通路调节细胞自噬[22]。以上研究表明，Wip1基因具有重要的生物学功能。

3 Wip1基因影响动物繁殖调控过程

基于Wip1基因在细胞周期、增殖、凋亡等方面的功能，其在动物繁殖调控方面也取得了进展。半定量PCR和Northern blotting技术检测发现，Wip1基因在小鼠胚胎及成体鼠肝脏、心脏、肾脏、睾丸、附睾等组织中均有表达，尤其在睾丸中表达最高，且随着日龄的增长Wip1基因mRNA在小鼠睾丸中的表达量不断升高[23]，表明Wip1基因可能与睾丸的发育有关。睾丸切片和免疫荧光染色结果显示，Wip1基因在圆形精细胞、长形精子中都有表达[23-24]，表明Wip1基因还可能和精子生成有关。小鼠体外受精结果发现，Wip1基因敲除小鼠精子游动能力弱，而其2-细胞发育率和囊胚率均极显著低于野生型小鼠[24]，这进一步证明了Wip1基因可调控小鼠的精子发生过程。Choi等[23]研究发现，Wip1基因敲除雄性小鼠与野生型雌鼠交配产生的后代明显减少，提示Wip1基因敲除可能会降低雄性小鼠生育能力。组织病理学研究发现，Wip1基因敲除导致小鼠生精小管退化和空泡化，失去正常细胞结构，推测可能是Wip1基因敲除导致雄性小鼠体内生殖激素水平失衡进而影响精子生成，且Wip1基因敲除小鼠的血清睾酮含量极显著低于野生型小鼠[24]，进一步佐证了Choi等[23]的研究结果。

随着研究的不断深入，Wip1基因对雄性繁殖的影响越来越受到关注。Filipponi等[25]研究报道，Wip1基因敲除雄鼠睾丸重量减少、睾丸结构异常、分化程度高的生殖细胞类型缺失、鱼精蛋白表达量降低、精子数量明显下降，这证实了Wip1基因缺失能够影响精子的发生；并进一步揭示了Wip1基因敲除通过激活ATM信号通路来调控乳腺癌1(breast cancer 1，BRCA1)和异染色质蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)的互作，使DNA甲基转移酶被招募至异染色质区域，提高异染色质区域的甲基化水平，导致DNA重复序列元件的沉默，进而干扰精子发生相关基因的正常表达，致使小鼠生殖能力下降。Wip1基因在雄性小鼠生殖发育过程中可促进Nemo样激酶(Nemo-like kinase，NLK)去磷酸化，从而激活Wnt信号通路，影响小鼠的精子生成[26]。因此，初步判断Wip1基因主要通过调控ATM和Wnt等信号通路来影响精子发生，进而影响生殖。Niu等[27]利用蛋白质组学技术筛选Wip1基因敲除雄性小鼠与野生型小鼠附睾组织的差异表达蛋白发现，这些蛋白主要富集于Smac/Diablo介导的凋亡通路和SERPINA3介导的炎症通路，推测Wip1基因可能通过调控以上2个通路影响精子生成过程。Wei等[28]在Wip1基因敲除雄性小鼠模型中利用定量蛋白质组学方法对睾丸组织分析发现，大部分差异表达蛋白和磷酸化蛋白主要参与了细胞黏附/紧密连接、凋亡过程、炎症反应、精子发生和运动等生物学过程，进一步证实Wip1基因敲除导致睾丸组织紧密连接蛋白(如Occludin、ZO-1和N-cadherin)表达降低，提示Wip1基因敲除导致睾丸组织中血睾屏障完整性受损，从而影响精子发生过程。

虽然Wip1基因能够影响小鼠雄性繁殖能力，但其在猪中是否也具有同样的作用呢？猪睾丸细胞对睾丸功能和精子发生起着调节作用，可影响公猪繁殖能力。Wip1基因敲除的猪睾丸细胞可为了解Wip1与细胞增殖、凋亡的关系提供良好的细胞模型[29]。Wang等[30]通过研究Wip1基因与猪睾丸细胞增殖发育关系表明，Wip1基因可能通过抑制p53磷酸化从而正向调控猪睾丸细胞的增殖。Xu等[31]将Wip1基因敲除梅山公猪和野生型公猪分别与野生型梅山母猪杂交发现，敲除猪配种的母猪的妊娠率、仔猪总产仔数和活产仔数均显著低于野生组。以上研究可为探索公猪繁殖能力提供新的着眼点。除了在小鼠和猪上的研究，Wip1基因在人类精子中也有表达，且Wip1基因正向调控精子浓度和精子DNA碎片指数，负向调控精子活力[32]，但具体机制有待深入解析。

Wip1基因通过动态平衡调节DNA损伤反应和去磷酸化作用来影响卵母细胞和胚胎发育，这为Wip1基因影响雌性动物的生殖提供了理论依据。Wip1基因通过影响卵母细胞的DNA损伤修复来调控生殖能力。Leem等[33-34]研究表明，抑制Wip1基因表达可显著促进小鼠卵母细胞G2前期阻滞过程中DNA损伤修复，推测Wip1基因可能是小鼠卵母细胞减数分裂过程中DNA损伤修复的关键抑制因子；抑制Wip1基因可以恢复老化卵母细胞的DNA修复能力，防止卵母细胞质量恶化，提高老化卵母细胞的受精和发育能力。Tan等[35]研究证实，在人妊娠子痫前期的胎盘滋养层细胞凋亡过程中，Wip1基因与p38存在反馈调节回路，以维持在缺氧应激条件下的细胞稳态。Park等[36]研究表明，Wip1基因可通过调控Smad4酶去磷酸化影响动物胚胎发育。Wip1基因可以调节妊娠期的造血发育，能通过改变细胞周期状态来调节胚胎造血过程中的造血干细胞前期成熟和增殖发育[13-14]，其作用机制可能是由mTORC1信号通路所致，这为Wip1基因如何在胚胎中调节造血干细胞功能做了初步探究。Zhou等[37]研究报道，Wip1蛋白的表达随着小鼠日龄增长而下调，在体外培养3 d的新生小鼠卵巢中加入Wip1抑制剂发现，与对照组相比，加入抑制剂组的原始卵泡显著减少；且抑制Wip1可通过激活p53-BAX-caspase-3途径加速原始卵泡闭锁，从而导致大量原始卵泡丢失，为了解卵巢老化过程中卵巢储备功能下降提供了有价值的信息。

4 Wip1基因调控机体免疫功能

研究证实，Wip1基因通过调控机体免疫细胞(包括T细胞、B细胞和中性粒细胞)的功能，从而在机体先天免疫系统和适应性免疫系统中发挥重要影响。Wip1基因缺失小鼠表现出一些异常，如皮肤溃疡、淋巴结异常增生、对病原体易感性增加，T细胞和B细胞功能低下等[23]。Wip1基因可正向调控T细胞发育和功能发挥。Schito等[38]研究发现，与野生型小鼠相比，Wip1基因敲除小鼠的胸腺髓样上皮细胞的成熟明显受阻，其原因可能为Wip1基因缺失使得p53活性升高，从而阻碍胸腺细胞双阴性阶段向双阳性阶段的进展，导致机体内T细胞数量明显减少，影响胸腺正常功能发挥。Sun等[39]研究揭示，Wip1基因可通过抑制p38 MAPK信号通路，正调控髓质胸腺上皮细胞的成熟、稳态和再生，调节T细胞功能的正常发挥。然而，Martinikova等[40]研究表明，Wip1基因缺失与T细胞的分化无相关性，仅可能影响胸腺细胞DNA损伤修复。miR-16与p53和Wip1的信号通路反馈环也可调节T细胞凋亡[21]。Wip1基因调控的磷酸酶能够减弱T细胞中DNA损伤修复反应，致使人外周血中的T细胞对凋亡敏感[41]。同时，Yi等[42]研究证实，Wip1基因正向调控B细胞发育和功能发挥，如Wip1基因敲除可能增强早期B细胞前体中p53依赖的凋亡信号通路，导致B细胞发育明显受阻，使骨髓、外周血和脾脏中B细胞数量明显减少。然而，在另一项有关Wip1基因敲除小鼠的研究中发现，脾脏中B细胞数量并无明显变化，但引起B细胞和T细胞部分功能受损[23]。由此可见，Wip1基因在B细胞和T细胞发育过程中起着重要作用，但是具体的调控机制尚未完全解析，仍需进一步研究。

此外，Wip1基因负调控中性粒细胞发育和功能发挥。Liu等[43]研究发现，在骨髓前体分化为成熟中性粒细胞的过程中Wip1基因表达呈明显上升趋势，Wip1基因缺失可能通过调控p38 MAPK-STAT1信号通路导致中性粒细胞发育和成熟明显增强。Sun等[44]研究发现，Wip1基因敲除小鼠炎症部位的中性粒细胞增多且迁移能力增强，并且机体对金黄色葡萄球菌的杀菌活性增强，推测可能是由于中性粒细胞中p38 MAPK介导的趋化因子受体2(chemokine(C-X-C motif) receptor 2，CXCR2)内化和脱敏降低导致的。Wip1基因在中性粒细胞的发育和成熟过程中起着关键性的调节作用，能够负向调节嗜中性粒细胞的迁移和炎症，可能是脓毒症治疗的潜在靶点[45]。在炎症性肠炎模型中，与野生组小鼠相比，Wip1基因敲除小鼠中促炎细胞因子和嗜中性粒细胞特异性标志物表达量显著升高[46]。Uyanik等[47]研究揭示，可通过化学抑制或基因敲除方法导致Wip1基因失活，促进肿瘤细胞分泌可溶性因子，从而降低中性粒细胞的凋亡发生率，延长细胞的寿命。Liu等[43]研究也进一步发现，Wip1基因缺失增加了小鼠血液内中性粒细胞的数量，并改变中性粒细胞的形态。Wip1基因可以通过负调控对巨噬细胞的迁移及吞噬作用产生影响[48]，这可为防止动脉粥样硬化斑块的形成提供一种新的思路。鉴于Wip1基因在免疫反应中起着重要的作用，其与大动物疾病的关系如何，是否可以平衡炎症引发的机体损伤，从而作为大动物抗病育种的靶点，值得深入探讨。

动物体正常的生理活动中免疫系统起到了关键作用，而免疫炎症与肿瘤发生又有着紧密的联系。研究发现，Wip1基因可促进线粒体的氧化磷酸化途径，增强巨噬细胞的自我更新能力，诱导肿瘤相关巨噬细胞向抑炎型巨噬细胞极化，进而促进肿瘤的发展[49]。Wip1基因在生殖细胞系中是一个DNA损伤应答(DNA-damage response,DDR)调节器，而DDR在癌症中常不受管制，导致了基因组的不稳定性，在癌症细胞中，肿瘤的进化可以从Wip1基因的致瘤作用和异染色质动力学、转座因子表达以及可能增强异质性的易突变环境的关系展开研究[25]。

Wip1基因作为原癌基因也可通过抑制p38 MAPK、p53、ATM、Chk2和MDM2等分子参与的信号通路调控机体内肿瘤(包括乳腺癌、结直肠癌和脑癌等)发生。Pechackova等[50]研究发现，小分子抑制剂GSK2830371可有效抑制Wip1基因的表达，引起细胞周期阻滞或细胞凋亡，从而阻止乳腺癌细胞的生长和扩散。Liu等[51]研究报道，Wip1基因和miR-21同时缺失可抑制乳腺癌细胞的增殖、生存和致瘤潜力，从而降低机体内肿瘤的生长和扩散。Mahdavi等[52]研究证实，Wip1基因是乳腺癌易感基因，Wip1基因表达调控能够增加遗传性乳腺癌的发生率。Wang等[53]通过构建早期病变乳腺癌模型发现，抑制Wip1基因活性可阻碍p38-MK2-Hsp27信号通路发挥正常功能，从而限制乳腺癌细胞的早期扩散。另外，有研究报道，Wip1基因在结直肠癌组织中显著高表达，可通过调控Wip1-KPNA2-Akt/GSK-3β和NF-κB-Wip1-mTOR-p21信号通路从而负调控抑癌因子p53表达，是引发结直肠癌发生的关键原因之一[54-56]。Burocziova等[57]通过构建Wip1基因突变小鼠模型发现，基因突变小鼠肠道细胞中的p53信号通路受到抑制，表现为促进结肠肿瘤生长并降低小鼠的存活率。Akamandisa等[58]在弥漫性固有桥脑胶质瘤细胞中发现，Wip1基因突变可抑制细胞DNA损伤修复，促进细胞凋亡。Wang等[59]研究表明，在弥漫性固有桥脑胶质瘤细胞中抑制Wip1基因表达能显著抑制细胞内DNA损伤修复，降低细胞活力，增加细胞死亡率。研究发现，Wip1基因截短突变是新生弥漫性中线胶质瘤形成的致癌驱动因素[60]；Wip1基因截短突变在髓系肿瘤患者中显著富集，会产生化疗耐受的表型，导致Wip1基因突变型造血细胞在体内外选择性扩增，且磷酸化蛋白质组学分析发现靶蛋白的磷酸化水平发生了变化，提示该突变可能影响了DDR反应等多条信号通路，在化疗药物的作用下，Wip1基因突变型细胞DDR反应受损导致细胞周期进程改变、凋亡减少、线粒体启动减少[61]。Wip1基因通过下调促凋亡p53蛋白2，增强Wnt/β-catenin信号通路，调控肿瘤细胞的生长和转移[62]，为研究Wip1基因对人胰腺癌的影响提供参考。也有研究报道，抑制Wip1基因表达可增加卵巢癌SKOV3细胞的凋亡，从而增强化疗对癌症的作用效果[63-64]。鉴于Wip1基因在肿瘤中的重要功能，将其作为治疗癌症的有效靶点有望成为新的研究方向。

5 小 结

Wip1基因通过调控相关因子或信号通路参与了动物机体内不同的生理和病理过程，但仍存在一些问题尚不明确：①虽然Wip1基因参与调控动物生殖发育，但其是否可以作为大动物繁殖性能相关的分子标记仍需大量研究；②Wip1基因在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用，而其抑制剂是否可应用于临床也需深入探讨；③Wip1基因调控机体生物学功能涉及到的一些关键调控机制和信号通路尚待进一步解析。因此，对这些问题展开深入研究，将有助于将Wip1基因应用于畜牧生产和临床实践，以便更好地改善动物的生产力和靶向基因治疗的效果。