韩 瑞，杨 行，张文波，陈佳玲，周晓丽

(江西农业大学动物科学技术学院，南昌 330045)

猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病，具有重要的公共卫生学意义。猪链球菌(Streptococcussuis,SS)是一种重要的病原体，可引起猪的败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎和脑膜炎及人的脑膜炎[1-2]。目前猪链球菌的致病机制仍不清楚，普遍认为其致病力强弱主要取决于其毒力因子[3]。现已报道的猪链球菌主要毒力因子有荚膜多糖(capsular polysaccharide,cps)、溶菌酶释放蛋白(muraminidase-released protein,mrp)、溶血素(suilysin,sly)、胞外蛋白因子(extracellular protein factor,epf)、三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,gapdh)等[4]。细菌肽聚糖水解酶(peptidoglycan hydrolase)又称自溶素(autolysin,atl)，可通过水解细菌细胞壁的特定糖苷键来溶解细菌细胞壁[5]，同时与细菌的细胞壁新陈代谢、细胞分离、细胞壁翻转、细胞壁重组和自溶等生物学特性密切相关[6-7]。除此之外，atl还与革兰氏阳性菌的致病性有关[8]。Zhang等[9]通过体内诱导抗原技术筛选猪链球菌2型(Streptococcussuistype 2,SS2)的毒力蛋白，结果发现，从SS2的超免疫血清中检测不到atl，但可从恢复期血清中检测到，提示atl可能参与了细菌的致病过程。Ju等[10]也通过试验证实atl与SS2的致病性有关。

目前，有关猪链球菌的检测方法主要有生化试验、凝集试验、免疫印迹试验、多重PCR等,但这些检测方法都较费时费力或需要昂贵的仪器等，而ELISA方法具有操作简便、经济、快速的特点，且该方法在中国各级兽医检测部门已应用多年[11]。截至目前，已有多种猪链球菌相关因子用于ELISA方法的建立，如gdh、mrp及分泌核酸酶(secreted nuelease A,ssnA)等[12-14]。顾宏伟等[5]通过PCR扩增临床上27株SS2的atl基因发现，均有606 bp大小的条带，证明atl基因普遍存在于SS2菌株中，具有良好的保守性，适合用于建立检测SS2抗体的间接ELISA方法。

本研究在克隆猪链球菌atl基因的基础上进行atl原核表达，以纯化的重组atl蛋白为抗原，建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA方法，以期为猪链球菌病的血清流行病学和防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及试验动物 pET-32a(+)质粒、pGEX-4T-1质粒；猪链球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、绿色气球菌和奈瑟氏菌，大肠杆菌、绿色气球菌和伪狂犬病病毒攻毒小鼠血清，猪链球菌感染阴阳性血清和不同饲养阶段的458份猪血清样品均由江西农业大学预防兽医学教研室保存；60日龄体重(1±0.3) kg的雌性健康新西兰大白兔购自江西省南昌市梅岭养殖场。

1.1.2 主要试剂 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；GST重组蛋白纯化试剂盒、His重组蛋白纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购自BBI公司；D2000 DNA Marker、Marker Ⅳ均购自TIANGEN公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪 IgG、4×蛋白上样缓冲液均购自Solarbio公司；弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA)均购自Sigma公司；XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶均购自Thermo公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank中登录的猪链球菌atl基因(登录号：EF127695.1)设计1对引物,引物序列为：F：5′-GCAGGATCCTCCTA-CACAGTCTATATTGA-3′；R：5′-CCGCTCGAGCTA-CTTTCCCTCAACAGCA-3′，下划线处分别为XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切位点，预期扩增片段长度为 606 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2atl基因PCR扩增 取纯化培养的猪链球菌分离菌菌液为模板，使用atl引物进行PCR扩增，PCR反应体系25 μL：2×FastTaqPremix 12.5 μL，模板1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并用DNA胶回收试剂盒对目的片段进行回收，回收产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将所测基因序列与GenBank中登录的SS2atl基因序列进行BLAST比对分析。

1.2.3 pET-32a-atl及pGEX-4T-1-atl重组表达质粒的构建及鉴定 分别对质粒pET-32a(+)、pGEX-4T-1及atl基因以BamHⅠ和XhoⅠ 进行双酶切，回收酶切质粒和atl基因，用T4 DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆经测序并与GenBank中登录的SS2atl基因序列进行BLAST比对后，提取重组表达质粒并转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆作为表达菌。

1.2.4 重组表达菌的诱导表达 将活化后的1 mL重组表达菌接种含氨苄青霉素(Amp+)的200 mL LB 培养基，37 ℃振荡培养 2～3 h 后，加入 IPTG 至终浓度 1 mmol/mL，继续振荡培养5 h，离心收集沉淀，经PBS洗涤后，加入1 mg/mL溶菌酶并进行超声波破碎裂解菌体，离心收集上清和沉淀，加入4×蛋白上样Buffer，沸水浴10 min，用 SDS-PAGE 检测表达情况。

1.2.5 融合蛋白的纯化 将破碎后的含pGEX-4T-1-atl和pET-32a-atl质粒的菌液经离心收集上清和沉淀后，使用His标签重组蛋白纯化试剂盒、GST标签重组蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化，纯化蛋白分别命名为atl-His及atl-GST融合蛋白。

1.2.6 融合蛋白的复性 将收集的包涵体形式表达的重组蛋白洗脱液用透析液A(20 mmol/L Tris-HCl，调pH 8.0)稀释，装入透析袋中，在4 ℃条件下依次在尿素终浓度分别为6、4、2、1 mol/L的1 L透析液A中进行透析，每12 h换液1次。随后于透析液B(20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、2 mmol/L EDTA、0.5 mol/L尿素，调pH 8.0)中4 ℃透析12 h；于透析液C(0.2 mol/L尿素，20 mmol/L Tris-HCl，25 mmol/L NaCl)中4 ℃透析12 h；用PEG8000对透析袋中液体进行浓缩，即为复性蛋白液，复性后的融合蛋白于-80 ℃保存备用。

1.2.7 多克隆抗体的制备及纯化 以atl-His融合蛋白为免疫原，首免时与等量弗氏完全佐剂乳化，后面几次免疫与等量弗氏不完全佐剂乳化，免疫新西兰大白兔，免疫前经耳缘静脉采血制备血清，-80 ℃保存备用，共进行4次免疫，每次免疫后7 d进行耳缘静脉采血，分离血清，检测抗体效价，最后心脏采血收集血液，分离血清，并用辛酸-硫酸铵的方法进行抗体的纯化。保存于-80 ℃。

1.2.8 Western blotting 验证atl-GST融合蛋白 将atl-GST融合蛋白经SDS-PAGE后转膜，恒流200 mA，60 min。以5%脱脂奶粉封闭，封闭后以1∶10 000稀释的抗atl兔多克隆抗体为一抗，以1∶5 000稀释的HRP-羊抗兔IgG为二抗，最终使用DAB显色。

1.2.9 间接ELISA 方法的建立

1.2.9.1 最佳抗原包被浓度和标准血清稀释度的确定 将atl-GST融合蛋白用PBS稀释至12.50、10.00、7.50、5.00、2.50和1.25 μg/mL，分别按100 μL/孔，4 ℃包被过夜，倾去孔内液体，PBS-T洗3次，拍干；以5%脱脂奶粉作封闭液，300 μL/孔，37 ℃封闭2 h，PBS-T洗3次，拍干；将猪链球菌阳、阴性血清按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560稀释，100 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS-T洗4次，拍干；加入以1∶2 000稀释的HRP-兔抗猪IgG酶标二抗，100 μL/孔，37 ℃作用1 h，PBS-T洗4次，拍干；按100 μL/孔加入底物溶液，37 ℃避光显色15 min，按50 μL/孔加入终止液终止反应，酶标仪测定D492 nm值，计算出阳性血清D492 nm值(P)与阴性血清D492 nm值(N)之比，选择P/N最大值为抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度。

1.2.9.2 封闭时间的优化 按照确定的条件包被抗原后，以300 μL/孔的5%脱脂奶粉封闭液，在37 ℃温箱中分别孵育1.0、1.5、2.0和2.5 h。其余步骤按1.2.9.1方法进行，根据P/N值确定筛选出封闭时间。

1.2.9.3 血清作用时间的优化 根据确定的条件，加入猪链球菌阴、阳性血清后分别作用1.0、1.5和2.0 h，其余步骤按1.2.9.1方法进行，根据P/N值确定筛选血清的最佳反应时间。

1.2.9.4 二抗作用时间和稀释度的优化 根据上述确定的条件，酶标抗体分别进行1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000稀释，37 ℃温箱中分别反应0.5、1.0和2.0 h，其余步骤按1.2.9.1方法进行，根据P/N值确定二抗最佳作用时间和稀释倍数。

1.2.9.5 显色时间的优化 根据上述确定的条件，加入底物OPD进行显色后，分别反应 10、15和20 min，用2 mol/L H2SO4终止反应，根据P/N值确定最佳显色时间。

1.2.9.6 临界值的确定 选取47份猪链球菌阴性血清，用优化好的 ELISA 反应条件进行检测。计算出阴性血清D492 nm值的平均值(X)和标准差(SD)；根据公式，临界值=X+3SD，大于或等于临界值的判断为抗体阳性，反之则为抗体阴性。

1.2.9.7 特异性试验 取超声波裂解后的屎肠球菌、大肠杆菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、绿色气球菌和奈瑟氏菌7个菌种的裂解液，稀释浓度为20 μg/mL包被酶标板，以纯化后的抗atl兔多克隆抗体为一抗(1∶2 000稀释)；另将atl-GST融合蛋白用PBS稀释至5 μg/mL包被酶标板，以大肠杆菌、绿色气球菌和伪狂犬病病毒攻毒小鼠血清作为一抗(1∶2 000稀释)，按照优化好的条件进行试验，测定每孔D492 nm值，用此方法来验证所建方法的特异性。

1.2.9.8 敏感性试验 选取1份阳性血清自1∶40起倍比稀释至 1∶2 560，按照优化好的条件进行试验，测定每孔D492 nm值，用此方法来验证所建方法的敏感性。

1.2.9.9 重复性试验 随机选取 12 份(记作P1～P12)不同的血清，按确定的条件进行反应，批内重复性试验：选取6份血清做7个重复(同一批次的抗原包被酶标板)；批间重复性试验：选取6份血清做4个重复(4个不同批次的抗原包被酶标板)。变异系数(%)=样本D492 nm值的标准差(S)/样本D492 nm值平均值×100%，用此变异系数来确定批内和批间的重复性。

1.2.9.10 与SS2 ELISA抗体检测试剂盒比较 利用本试验建立的ELISA方法与武汉科前生物有限公司的SS2 ELISA抗体检测试剂盒对实验室保存的184份血清进行检测，比较2种方法的符合率。

1.2.9.11 临床样品检测 用建立的猪链球菌自溶素抗体间接 ELISA 方法检测来自江西省部分地区的不同饲养阶段的458份猪血清样品，其中哺乳仔猪200份样品，保育仔猪47份样品，母猪185份样品，公猪26份样品，确定其阳性率。

2 结 果

2.1 atl基因扩增及重组质粒鉴定

从猪链球菌分离株中扩增到1条大小约606 bp的基因片段,经测序和BLAST比对分析，所测基因序列与GenBank中登录的SS2atl基因序列相似性为100%。随机挑6个重组菌菌落进行菌落PCR，结果显示，均可见大小约606 bp的明显条带(图1)；重组质粒pGEX-4T-1-atl和pET-32a-atl经双酶切鉴定结果显示，均获得大小约606 bp的目的条带(图2)。测序及BLAST比对分析结果显示，插入序列与atl基因序列相似性为100%。

M，D2000 DNA Marker;1～5，阳性菌落；6，阳性对照;7，阴性对照

M1，D2000 DNA Marker；1，pGEX-4T-1；2，pGEX-4T-1-atl 重组质粒；3，pGEX-4T-1-atl BamHⅠ和 XhoⅠ 双酶切；M2，Marker Ⅳ；4，pET-32a(+)；5，pET-32a-atl重组质粒；6，pET-32a-atl BamHⅠ和 XhoⅠ 双酶切

2.2 融合蛋白的诱导表达和纯化结果

经诱导表达，SDS-PAGE结果显示，pET-32a-atl重组表达菌株在约40 ku处有明显条带，大小与预期相符，主要以包涵体形式表达(图3)；pGEX-4T-1-atl重组表达菌株在约48 ku处有明显条带，大小与预期相符，主要以包涵体形式表达，也可以可溶性形式表达(图4)。经复性纯化浓缩后，均获得较高纯度的融合表达蛋白。

M，蛋白质分子质量标准;1，pET-32a(+)未诱导;2，pET-32a(+)诱导;3，pET-32a-atl未诱导;4，pET-32a-atl诱导;5，pET-32a-atl裂解液上清;6，pET-32a-atl裂解液沉淀;7，pET-32a-atl纯化蛋白

M，蛋白质分子质量标准;1，pGEX-4T-1未诱导;2，pGEX-4T-1诱导;3，pGEX-4T-1-atl未诱导;4，pGEX-4T-1-atl诱导;5，pGEX-4T-1-atl裂解液上清;6，pGEX-4T-1-atl裂解液沉淀;7，pGEX-4T-1-atl纯化蛋白

2.3 atl-His融合蛋白免疫兔的抗体检测结果

对atl-His蛋白免疫4次后的兔血清进行ELISA检测，结果显示在血清稀释度到达1∶32 000时，2只试验兔仍有较高的抗体水平(图5)。

图5 atl-His免疫兔抗体水平

2.4 atl-GST融合蛋白的免疫原性检测

将atl-GST融合蛋白经SDS-PAGE后转膜进行Western blotting检测，结果在48 ku处有明显的条带(图6)，与预期大小一致，表明纯化的atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性。

图6 兔多克隆抗体Western blotting验证结果

2.5 间接ELISA 方法的建立

2.5.1 ELISA 最佳反应条件的确定 根据P/N 值最大的原则确定最佳反应条件，由表1～6可知，atl蛋白的包被浓度为5.0 μg/mL，血清稀释度为1∶80，5%脱脂奶粉封闭2.0 h，血清作用时间为1.0 h，酶标二抗稀释度为1∶2 000作用30 min，OPD显色时间10 min时效果最好。

表1 抗原包被浓度及血清稀释度的确定(D492 nm值)

表2 封闭时间的确定(D492 nm值)

表3 血清作用时间的确定(D492 nm值)

表4 酶标二抗稀释度的确定(D492 nm值)

表5 酶标二抗作用时间的确定(D492 nm值)

表6 显色时间的确定(D492 nm值)

2.5.2 阴、阳性血清临界值的确定 用上述优化好的条件对48份猪链球菌阴性血清进行检测，以确定临界值，根据D492 nm值，计算出阴性血清的平均值(X)=0.22373，标准差(SD)=0.03126，临界值=X+3SD=0.22373+3×0.03126=0.318。所以该方法的判定标准为：检测样品的D492 nm值≥0.318为阳性，D492 nm值<0.318为阴性。

2.5.3 重复性试验 重复性试验结果显示，批内变异系数为1.65%～2.65%(表7)，批间变异系数为3.31%～8.23%(表8)，均低于10%。表明该方法具有良好的重复性。

表7 批内重复性试验结果(D492 nm值)

表8 批间重复性试验结果(D492 nm值)

2.5.4 特异性试验 以7个菌种的超声波裂解液为抗原，纯化后的抗atl兔多克隆抗体为一抗对其特异性进行验证，结果显示，其D492 nm值均<0.184，阳性对照D492 nm值均>1.325，表明抗atl兔多克隆抗体不与其他7种细菌的超声波裂解液反应。以atl-GST融合蛋白为包被抗原，以大肠杆菌、绿色气球菌和伪狂犬病病毒攻毒小鼠血清作为一抗对其进行特异性验证，结果显示，其D492 nm值均<0.136，其阳性对照血清D492 nm值均>5，表明攻毒小鼠血清不与atl-GST融合蛋白反应。以上试验显示本试验建立的间接ELISA方法特异性良好。

2.5.5 敏感性试验 用优化好的条件对 1 份阳性血清稀释后进行检测，结果显示，当血清 1∶1 280 稀释时，结果仍为阳性(图7)。表明所建立的方法敏感性较高。

图7 敏感性试验结果

2.5.6 与SS2 ELISA抗体检测试剂盒比较 在检测的184份血清样本中，本试验建立的间接ELISA方法检出96份阳性，88份阴性；SS2 ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性，118份阴性。本试验所建立的间接ELISA阳性检出率高于SS2的商用试剂盒，其中检测结果相符的样本数为132份，检测结果不符合的样本为52份，总符合率为71.7%。

2.5.7 临床样本的检测 用本试验所建立的间接ELISA方法对来自养殖场的458份猪血清经1∶80稀释后进行检测，结果显示，共检出atl抗体阳性 277份，总阳性率为60.4%，其中成年公、母猪血清样品检测阳性率最高，达87.5%，而哺乳仔猪和保育小猪阳性率较低，分别为37.5%和36.1%(表9)。

表9 临床血清样品的抗体检测结果

3 讨 论

致病性猪链球菌不仅严重影响养猪业的健康发展，也可跨物种感染人，危害公共卫生安全。自2005年中国四川省首次发现猪SS2感染人后[15]，各地频频暴发类似疾病，江西省于2014及2019年发生猪链球菌感染人事件[16]。近年来，随着限抗、替抗政策的实施和疫病流行形势的变化，猪场的猪链球菌分离率也不断增加，危害也在加剧。赵战勤等[17]在2011—2015年不同地区2 521份发病猪病料组织样品中分离到772株猪链球菌，占总分离细菌的30.6%，为分离率最高的细菌性病原。石大丽等[18]对2018年1～6月份广西部分地区的疑似猪链球菌感染的猪组织病料进行检测，阳性率为27.59%；沈艳玲[19]对2019—2020年江苏某市屠宰场健康猪扁桃体进行猪链球菌分离和鉴定，阳性率为 51.85%；刘召颖等[20]对2020—2021 年从浙江某市屠宰场采集的健康猪扁桃体样品进行检测，阳性率达62.59%。因此，了解猪场猪链球菌的流行病学规律，对防控猪链球菌病有重要意义。血清流行病学调查可了解猪场疾病的分布和流行规律、疫苗免疫效果和治疗效果，是传染病流行病学调查的重要组成部分，其最常用的方法ELISA方法。目前，已建立了多种猪链球菌的抗体ELISA检测方法[21]。1993年Vecht等[22]建立了双抗夹心 ELISA 技术；张玲妮[23]利用 SS29801 株及该菌的荚膜多糖(CPS)提取物分别建立了2种间接ELISA方法，但其特异性和灵敏度均无法满足临床检测；高地[24]建立了SS2免疫磁珠夹心 ELISA 检测方法，其条件要求较高，不适合商品化应用；周明光[25]利用SS2菌株的CPS作为包被抗原建立了检测SS2血清抗体的间接ELISA方法，临床应用效果较好；欧瑜等[26]用MRP、EF蛋白建立了DOT-ELISA和间接ELISA 2种检测方法；孙雯等[27]则建立了重组烯醇化酶(enolase)抗体的间接ELISA方法，对SS2感染的血清诊断有一定的应用价值。上述研究均以SS2为研究对象，应用范围较窄。因此，建立针对致病性猪链球菌均能检测的快速ELISA方法就显得尤为重要。

atl是致病性猪链球菌中重要的毒力因子之一，参与猪链球菌的多种致病过程。顾宏伟等[5]研究结果显示，在27株致病SS2中均可检测到atl基因，只在1株无毒力的SS2中未检出；而本实验室对2019-2021年江西省规模化猪场的病死猪中分离的16株链球菌进行atl基因检测和分析，10株致病性较强的SS9和1株SS1均可检出atl基因，且序列保守性强，而其他几株无法分型链球菌和非解乳糖链球菌中均未检出(数据未发表)。霍琳红等[28]对肺炎链球菌的研究结果表明，自溶素对感染肺炎链球菌小鼠IgG类抗体诊断的敏感性和特异性分别为41.7%和100.0%。邹琴等[29]利用肺炎链球菌自溶素建立的ELISA方法测定社区获得性肺炎(CAP)患者血清中的抗体，结果表明，CAP患者血清标本中IgG和IgM类抗自溶素抗体滴度均高于健康对照组。据此推测，当致病性猪链球菌感染时，atl诱导的抗体水平会升高，而非致病性和正常作为正常菌群的链球菌感染，atl诱导的抗体水平一般较低。因此，atl蛋白适合用作建立猪链球菌抗体检测ELISA方法的靶抗原。

本研究利用原核诱导表达、亲和层析法纯化猪链球菌atl融合蛋白，并通过条件优化建立了检测猪链球菌抗体的ELISA方法，由于目前有关猪链球菌 ELISA检测的商品化试剂盒较少，所以仅与市面上的SS2 ELISA抗体检测试剂盒进行比较分析，结果表明本研究建立的ELISA方法阳性检出率高于SS2 商用试剂盒，其原因可能是由于本试验建立的间接ELISA方法可检出大多数血清型的猪链球菌，而SS2 ELISA抗体检测试剂盒主要检出SS2。对临床猪血清进行检测，平均阳性率为60.4%。马昊杰[30]对2017—2019年酒泉市肃州区的SS2进行血清学调查，总阳性率为33.56%；陆亚男等[31]于2020年对上海地区种猪场的健康猪群猪进行猪链球菌监测，阳性率为58.11%；贺亚楠[32]2016年对江苏部分地区的健康猪群进行猪链球菌流行病学调查，阳性率为60.42%；刘琪等[33]对广东地区健康猪群和发病猪群进行猪链球菌流行病学调查，结果显示发病猪群和健康猪群猪链球菌的阳性率分别为82.02%和42.20%；谭美芳等[34]对江西省5个规模猪场的猪链球菌流行情况进行调查，结果猪群的阳性率为 62.86%。上述研究结果与本研究结果基本相符，表明本研究建立的猪链球菌atl抗体ELISA检测方法灵敏度较高、特异性较强，适合养猪生产中猪链球菌血清流行病学调查和猪链球菌病的辅助诊断。

4 结 论

本研究利用纯化的重组猪链球菌atl蛋白成功建立了检测猪链球菌抗体的间接ELISA方法，该方法的敏感性、特异性和重复性良好；对临床采集的猪血清进行检测，平均阳性率为60.4%，具有较好的应用前景。