刘国彬 姚砚武 曹均

(北京市农林科学院林业果树研究所，北京,100093)

欧李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)属蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，是我国特有植物资源[1-2]，主要分布在我国东北、华北、西北等干旱、寒冷地区及华东、华中部分地区[3-4]，具有重要的生态、观赏、食用和保健价值[5-8]。欧李作为北方地区特色的生态经济型资源，我国学者在品质评价[9]、亲缘关系分析[3，10]、基因克隆[11-12]等方面进行了持续研究，在欧李资源调查、收集、开发与利用方面取得较大进展，选育出了一批优良品种[6，13-16]。“十三五”期间，北京市农林科学院林业果树研究所在国家科技基础性工作专项“华北山区经济树种种质资源收集和保存”项目的支持下，收集欧李资源300余份，选育优良种质50余份，审定良种1个。随着近年来各地欧李资源的相互引进，不同产地的欧李资源经过多次引进后，资源身份信息被人为混淆，因此开展新品种保护、种质鉴定及亲缘关系分析等工作对于欧李资源引种、种质保护与利用极为重要。

欧李种质鉴定与分类的传统方法主要有形态学和同工酶分析[17-18]，但由于受环境影响较大、稳定性较差，在种质鉴定上存在一定的局限性。随着分子标记技术的开发与应用，多种分子标记在植物遗传多样性分析、亲缘关系分析与品种鉴定等方面得到应用，包括RAPD、ISSR、SRAP、AFLP、SSR等，其中SSR标记具有共显性、多态性高、稳定性好等特点，是一种高效的分子标记技术，和SNP标记一起在BMT测试指南草案中被推荐为适合构建品种指纹图谱数据库的两项技术。目前，SSR标记已经成功应用于葡萄、枸杞、月季、茶树等植物品种指纹图谱的构建[19-22]，而有关SSR标记在欧李种质分子身份证构建上的应用较少。

本研究以北京市农林科学院林业果树研究所收集保存的欧李优良种质及近缘种李、杏李为试材，利用荧光SSR标记技术，构建15个欧李优良无性系的分子身份证，旨在保护欧李优新品种的知识产权，并为欧李种质资源的分子鉴定奠定理论基础和提供分子技术支撑，这对于欧李及其近缘属植物新品种选育及品种保护具有重要意义。

1 材料与方法

本研究所用材料均从北京、天津、河北、山西等地欧李自然分布区收集保存的优良种质，均为野生资源，通过实生选优获得，共19份(表1)，其中欧李种质15份，近缘属李3份，杏李1份，均通过嫁接方式保存于资源圃内。于5月初采集供试欧李及其近缘种的幼嫩叶片，硅胶干燥，用于基因组DNA提取。

1.1 基因组DNA提取与引物筛选

叶片基因组DNA的提取采用CTAB法[23]，加入30～50 μL TE-buffer，紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，稀释至30 mg·L-1保存备用。

试验所用的SSR引物参考欧李近缘种属李属的樱桃、桃及杏上发表的引物[24-29]，分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，从21对引物中筛选出条带清晰、多态性高的13对SSR引物(表2)，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，用FAM(蓝色)荧光修饰上游引物5’端，对19份材料进行分析。

表1 供试19份种质及分子身份证编码

表2 试验选用的SSR引物基本信息

1.2 DNA扩增和毛细管电泳

25 μL的SSR标记的PCR反应体系包括2×Taq PCR mix 12.5 μL，10 μmol·L-1上游引物0.5 μL，10 μmol·L-1下游引物0.5 μL，30 mg·L-1DNA模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL。

PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65～55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行35个循环；72 ℃延伸5 min后4 ℃保存。

将甲酰胺与分子质量内标ROX500按100∶1的体积混合后，取9 μL加入96孔上样板中，再加入1 μL稀释10倍的PCR产物，使用ABI 3730 XL sequencer进行毛细管电泳。

1.3 数据处理

利用软件GeneMapper 4.0分析原始数据并获得每对引物在不同样品上的扩增片段长度，利用Conert 1.31软件转化成POPGENE分析所要求的格式，然后使用POPGENE 1.32软件进行统计分析，基于NTsyspc2.10软件利用UPGMA法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

欧李叶片基因组DNA提取后通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性(图1)。从蔷薇属植物已公布的SSR引物中挑选多态性较好的21对引物(表2)，随机抽取6个欧李无性系DNA混合形成2个混合DNA模板，然后利用21对SSR引物进行PCR扩增验证，共获得能够稳定扩增且条带清晰的引物13对，即BPPCT040(引物1和13)、PceGA59(引物3)、Pchcms4(引物4)、Pchgms4(引物5)、UDP96-008(引物7)、UDP97-403(引物8和19)、UCD-CH31(引物10)、PTCR22(引物11)、BPPCT008(引物12)、EPPCU9168(引物16)、MA007a(引物17)、UDAP-429(引物18)、UCD-CH17(引物21)。使用13对具有较好多态性的引物对欧李优良无性系和近缘种共19份资源进行分析。

2.2 SSR引物扩增多态性

13对引物在19份材料中共检测到基因片段98个，每对引物检测到的基因片段为3～12个，平均基因片段7.5个，最少的Pchcms4引物只扩增出3个基因片段，最多的BPPCT040扩增出来12个基因片段，其中检测到的基因片段数超过平均值的有7个，分别为BPPCT040、Pchgms4、EPPCU9168、MA007a、PTCR22、UDAP-429与PceGA59(表3)。

表3 欧李种质资源及其近缘种的遗传多样性参数

13对引物在19份材料中共检测得到等位基因88个，每对引物检测到的等位基因数在2～12个，平均每对引物扩增出6.7个等位基因，有效等位基因数为3.822 4。13对SSR引物间存在较大差异，其中观测等位基因数最多的引物是BPPCT040，为12个，其有效等位基因数为6.504 5；其次为Pchgms4、EPPCU9168，观测等位基因数分别为11、10个，对应的有效等位基因数分别为7.520 8和4.349 4；观测等位基因数最少的是引物Pchcms4，只有2个，有效等位基因数为1.566 2。13对SSR引物中，扩增的等位基因数超过平均值的有5对，分别为BPPCT040、Pchgms4、EPPCU9168、PTCR22、PceGA59。等位基因数和等位基因片段数越多，该引物的多态性越高，在不同种质中的鉴定能力越强，13对SSR引物可区分欧李种质资源数量从3～11份不等，平均每对SSR引物可区分6份种质，区分率为16.67%～91.67%，其中区分率最高的是引物BPPCT040，其对应的等位基因片段数和等位基因数最大，可区分11份种质；最低的是引物Pchcms4，其对应的等位基因片段数和等位基因数最小，仅能区分2份种质(表4)。部分种质在位点BPPCT040的指纹图谱见图3。

表4 单一引物在欧李种质中的区分率

13对SSR引物的多态信息含量范围为0.296 1(Pchcms4)～0.853 3(Pchgms4)，平均值为0.629 7，表明这些引物在欧李种质扩增中具有多态性。期望杂合度(He)和观测杂合度(Ho)的变化范围分别为0.371 3(Pchcms4)～0.890 5(Pchgms4)、0.052 6(PceGA59与Pchcms4)～1.000 0(BPPCT040)，平均分别为0.683 3、0.429 1。Shannon信息多样性指数的变化范围为0.547 4(Pchcms4)～2.179 9(Pchgms4)，平均为1.435 2，说明本研究所选欧李种质具有较为丰富的遗传多样性。

2.3 亲缘关系分析

本研究采用NTSYS-PC计算欧李种质及其近缘种属植物的遗传相似性系数和遗传距离(表5)。不同欧李种质间的遗传相似度在0～1，其中Cerhu-7与Cerhu-8两者之间，Cerhu-13、Cerhu-14与Cerhu-15三者之间的遗传相似系数最高(1.000 0)，推测Cerhu-7与Cerhu-8为收集的同一种质，Cerhu-13、Cerhu-14与Cerhu-15为同一种质，可能在保存过程中混淆所致。其余种质间遗传相似系数在0.359 1～0.733 7。不同种质欧李与近缘种属杏李及3份李种质的遗传相似系数均在0.13以内，杏李与3份李种质间的遗传相似系数在0.524 4～0.524 8，不同李种质间的相似系数在0.863 6～0.954 5。根据13对SSR引物对19份种质的扩增结果，采用UPGMA法对所有供试种质进行聚类分析(图4)，结果表明，在遗传相似性系数为0时，将供试材料分为两大类，其中15份欧李种质聚为一类，杏李及3份李种质聚为一类，进一步说明欧李与杏李、李间亲缘关系较远，而杏李与李亲缘关系较近，供试李种质批次间亲缘关系最近。在15份欧李种质中，亲缘近的聚为一类，如来自天津地区的Cerhu-1、Cerhu-11、Cerhu-2、Cerhu-7与Cerhu-8聚为一类，来自河北地区的Cerhu-3、Cerhu-4、Cerhu-9、Cerhu-12、Cerhu-13、Cerhu-14、Cerhu-15聚为一类，来自山西地区的Cerhu-5、Cerhu-6、Cerhu-10聚为一类。聚类结果进一步表明Cerhu-7与Cerhu-8为同一种质，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15为同一种质。

表5 欧李不同品种间遗传距离和遗传相似性系数的无偏估计值(Nei)

续(表5)

2.4 分子身份证构建

根据13对SSR引物扩增获得的基因片段大小按从多到少排序，将各对引物获得的基因片段按照从小到大的顺序排列，并从阿拉伯数字1开始赋值，若基因片段超过9个，多出部分从英文小写字母a开始赋值，因本研究中检测到最多的基因片段为12，对应赋值范围为1-9+a-c(表6)。若有2对以上的引物检测到同等数量的基因片段，则按照各对引物中基因片段的大小对引物位置进行排序。如本研究中引物BPPCT040检测到的基因片段最多(12个)，排在第1位，而在该引物检测到的最小基因片段中，最小值119 bp,赋值1，最大值为141 bp，赋值c；引物Pchgms4和EPPCU9168检测到的基因片段均为11个，但引物Pchgms4检测到的最小基因片段为146 bp，而EPPCU9168检测到的最小基因片段中最小值为173 bp，则引物Pchcms4排在第2位，EPPCU9168排在第3位；引物Pchcms4检测到的基因片段数最少(3个)，排在最后一位，以此类推。根据15份欧李种质的亲缘关系分析结果，推测Cerhu-7与Cerhu-8为同一种质，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15为同一种质；本研究根据表6中对基因片段的赋值标准和13对SSR引物对不同欧李种质的扩增结果，对剩余12份亲缘关系不同的欧李种质及1份杏李、3份李种质进行分子身份证编码，结果显示(表1)，选取的13对引物可以将16份材料进行有效区分和编码，其中以基因片段数大于平均值为主的7对引物的两两组合中，区分率出现83.33%和100.00%，其中有13组引物组合可将12份欧李种质完全区分，8组引物组合可区分11份欧李种质(表7)，而近缘属种的3份李种质则需要13对引物才能完全区分。

本研究将每份欧李种质在13个位点获得的等位基因片段按照赋值数字(含字母)编码获得每份种质独有的分子身份编码(表1)，其中，推测为同一种质的Cerhu-7与Cerhu-8具有相同的分子身份编码，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15具有相同的分子身份编码，其余种质具有独属于自己的分子身份编码。

表6 SSR引物扩增基因片段大小 bp

表7 基因片段数大于平均值的7对引物组合的区分效率

3 讨论

优良种质资源的精准鉴定是植物新品种保护的基石，为每一个物种找到一个快速、准确的鉴定方法，对植物新品种保护与利用至关重要，分子指纹图谱、分子身份证是植物基因资源鉴别、种质鉴定和植物新品种保护的重要遗传学工具，利用分子标记技术构建欧李不同种质分子身份证，对于欧李种质创新与品种保护具有重要意义。目前，用于分子身份证构建的分子标记技术主要有RAPD、ISSR、SRAP、SSR、AFLP及InDel、CDDP等，其中SSR标记具备多态性高、稳定性好等优点，已被广泛应用与果树与林木的分子身份证或指纹图谱构建，如基于SSR标记技术构建了葡萄、苹果、刺槐、杨树等种质资源的分子身份证。本研究利用筛选出来的13对SSR引物对15份欧李种质资源、1份杏李资源和3份李资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，平均每对引物检测到的等位基因数为6.7个，平均每对引物检测到的等位基因片段数为7.5个；多态信息含量变幅在0.296 1～0.853 3，平均0.629 7；Shannon信息指数变幅在0.547 4～2.179 9，平均为1.435 2。本研究结果与尹跃等[20]利用24对SSR引物对16个枸杞品种进行扩增的结果类似，较毛秀红等[30]的研究结果高，分析认为一方面可能与供试材料间遗传背景差异大有关，19份供试种质来源于4个不同地区且欧李材料均为野生种质；另一方面也说明所选引物具有较高的多态性，也反映了多态信息含量、Shannon信息指数以及等位基因数的大小与SSR引物的数量多少关系不大，但与引物自身多态性密切相关。

DNA指纹图谱的获得是构建分子身份证的基础。高源等[31]基于SSR标记技术获得了供试苹果种质的指纹图谱数据和引物多态性，并通过对比分析获得可将所有材料完全区分的核心引物，然后将核心引物获得的等位基因按照从大到小的顺序排列，并用阿拉伯数字从1开始赋值，从而获得每份材料独有的字符串，再利用条码技术将每份材料按相同位点顺序排序的编码字符串转化成每份材料独特的条码标识；王慧玲等[22]则是在获得指纹图谱的基础上，采用最小等位基因编码法，即根据每对引物对不同材料扩增片段对应的分子质量大小，按从小到大依次编码，当引物扩增的某一品种等位基因有2个时，按等位基因碱基数较小的条带编码赋值，从而获得供试材料的分子身份证。本研究先通过亲缘关系分析和聚类分析，将同物异名种质进行区分，然后采用与葡萄[22]、桃[32]类似的编码方法构建供试欧李种质及其近缘种的分子身份证，唯一不同的在于本研究所选部分引物的扩增条带数超过9条，因此除了赋值1～9外，超过9条的部分从英文小写字母“a”开始赋值，用阿拉伯数字与英文字母结合的方式编码赋值，构建了15份欧李种质、1份杏李和3份李种质的分子身份证，为后续欧李新品种保护和种质引进与利用提供科学依据。

4 结论

本研究基于琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳从欧李近缘种属已公布的SSR引物中筛选出多态性丰富、扩增稳定性好的引物13对，对15份欧李、1份杏李、3份李共计19份种质进行遗传多样性分析和亲缘关系鉴定，共检测到等位基因88个，每对引物检测到的等位基因数在2～12个，平均6.7个；获得等位基因片段98个，每对引物获得的等位基因片段数在3～12个，平均7.5个。多态信息含量变幅在0.296 1～0.853 3，平均为0.629 7；Shannon信息指数变幅在0.547 4～2.179 9，平均为1.435 2。亲缘关系分析将欧李种质分为3类，并与欧李资源收集地域相吻合；确定了欧李种质Cerhu-7与Cerhu-8为同一种质，Cerhu-13、Cerhu-14和Cerhu-15为同一种质，剩余12份材料为亲缘关系不同的种质；相较于欧李，杏李与李亲缘关系较近，且供试3份李种质亲缘关系最近。13对SSR引物可区分欧李种质资源数量从3～11份不等，平均每对SSR引物可区分6份种质，区分率为16.67%～91.67%，以基因型大于平均值为主的7对引物的两两组合中，有13个引物对组合可完全区分亲缘关系不同的欧李种质。本研究在获得DNA指纹图谱原始数据的基础上，采用最小等位基因编码法构建了不同亲缘关系的欧李种质及其近缘种的分子身份证，结果说明SSR标记技术是植物分子指纹图谱构建的有效手段，同时本研究结果也证实SSR引物在种属间具有通用性。