AREG对绵羊卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

2022-11-07王兆琛赵勇超张家新

中国农业大学学报 2022年11期

王兆琛赵勇超杜炜张宇张家新* 安磊

(1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018； 2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193)

颗粒细胞的快速增殖是处在发育中的优势卵泡的特征之一。与壁层颗粒细胞相比，卵丘(颗粒)细胞富含更多与细胞增殖和代谢相关的转录本。壁层颗粒细胞对葡萄糖的利用较少，卵泡吸收的葡萄糖则主要由卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes, COCs)代谢。

双调蛋白(Amphiregulin, AREG)作为一种表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)类因子，最初在壁层颗粒细胞中表达，然后在壁层颗粒细胞和卵丘细胞上结合表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)并激活下游信号通路。在卵泡发育过程中，卵丘细胞获得功能性的EGFR信号是一个里程碑性的事件，排卵前卵泡液中的AREG含量也与卵母细胞的发育潜力密切相关。另外，有研究表明卵母细胞分泌因子(Oocyte-secreted factors, OSFs)，如骨形态发生蛋白15(Bone morphogenetic protein 15, BMP15)和生长分化因子9(Growth differentiation factor 9, GDF9)，通过SMAD2/3途径促进卵丘细胞上EGFR的表达。

卵丘细胞的葡萄糖代谢对卵母细胞的成熟以及受精后的胚胎发育潜能至关重要，卵丘细胞通过间隙连接通讯(Gap-junctional communication, GJC)将葡萄糖转运进卵母细胞或者为卵母细胞提供可利用的底物。卵丘细胞通过糖酵解和磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway, PPP)代谢葡萄糖支持卵母细胞成熟，并且通过PPP产生的NADPH对于卵母细胞的抗氧化功能尤为重要。在绵羊的研究中发现，卵丘细胞糖酵解、PPP的激活以及卵母细胞氧化还原状态的改善可能有利于卵母细胞的成熟。此外，AREG可以促进牛COCs糖酵解，AREG与OSFs结合可以提高卵母细胞内的NADPH水平及体外受精后的胚胎发育能力。

在绵羊体外胚胎生产中，来源于小腔卵泡的卵母细胞不能被有效的利用，其中一个主要原因是小腔卵泡卵母细胞的体外成熟(

vitro

maturation, IVM)质量较差，发育能力较低。近年来，有许多研究针对卵丘细胞分析不同直径腔卵泡之间细胞增殖、代谢及信号转导的差异，普遍认为小腔卵泡的卵丘细胞上EGFR信号通路没有被充分激活，限制了卵母细胞的发育能力。在多种动物上的研究表明，AREG等EGF类因子激活COCs中卵丘细胞的EGFR信号通路，提高了卵母细胞的成熟质量。但在绵羊卵丘细胞上，还没有研究证明不同直径腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢的差异，以及AREG对葡萄糖代谢的影响，且COCs的研究无法排除卵母细胞对卵丘细胞的影响。因此，本研究以绵羊卵丘细胞为研究对象，为来源于中、小腔卵泡的卵丘细胞提供相同的OSFs条件，探究AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢的影响，为绵羊卵母细胞成熟机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

动物样品

自屠宰场收集的绵羊离体卵巢需保存在含有青霉素和链霉素的无菌生理盐水中，于保温瓶保持温度在30～35 ℃，4 h内送回实验室进行后续试验。

试剂与药品

TCM-199基础培养液、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)和青链霉素合剂(Penicillin-strepto，PS)购自于Gibco公司，AREG、GDF9和BMP15购自于R&D Systems公司，促卵泡素(FSH)购自于Bioniche公司，CCK-8购自于北京全式金生物技术公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司，葡萄糖测定试剂盒购自于上海荣盛生物技术公司，NADPH检测试剂盒和乳酸检测盒购自于南京建成生物工程研究所，增强型ATP检测试剂盒购自于上海碧云天生物技术公司。

1.2 试验方法

COCs的采集

试验所需绵羊卵巢取自呼和浩特屠宰场。将绵羊卵巢用含有1%青链霉素合剂的生理盐水清洗。在卵巢表面分别选取直径2～6 mm的中腔卵泡和直径<2 mm的小腔卵泡，使用带有9#、7#针头的10 mL注射器分别抽取中、小腔卵泡内容物。于体视显微镜下挑选抽取获得的COCs，选择胞质均匀且外周包裹有3层以上卵丘细胞的COCs，用于后续实验。

卵丘细胞的分离培养

将50枚COCs用震荡器震荡5 min后，收集分散的卵丘细胞, 在1 350 r/min下离心5 min，除去上清。然后用培养液离心洗涤2次，除去上清后用培养液将细胞重悬, 接种到培养皿中于 37 ℃，5% CO2，95%空气，饱和湿度下培养。培养液为: TCM-199培养基+10% FBS +1% PS。按照试验设计在培养液中添加0、5、10、50、100 ng/mL的AREG；添加或不添加0.5个/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。

卵母细胞的体外成熟

基础成熟液是TCM-199+10 μg/mL FSH+3 mg/mL BSA+1%PS，按照实验设计在基础成熟液中分别添或不添加100 ng/mL AREG、GDF9及BMP15。每20枚COCs放入100 μL成熟液滴中，38.6 ℃，5% CO，95%空气，饱和湿度下培养24 h。

试验设计

本研究分别利用分离的卵丘细胞和COCs开展试验(表1)。在试验2中为了提供卵源性OSFs添加脱光卵丘细胞的卵母细胞(Denuded oocytes, DOs)，试验2、3和4中添加的GDF9和BMP15为外源性OSFs。

荧光定量PCR检测基因表达收集50枚来源于不同直径卵泡COCs中的卵丘细胞，使用Trizol抽提法提取细胞总RNA，按照PrimenScriptRT Master Mix Kit试剂盒操作说明进行反转录合成cDNA。

G6PDH

、

PFKM

、

PFKM

和内参基因

YWHAZ

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及退火温度见表2。反映条件为：预变性：95 ℃ 5 min；变性：95 ℃ 30 s；退火：60 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s；35个循环；4 ℃终止。以

YWHAZ

基因为内参，根据2法计算各基因mRNA的相对表达量。

卵丘细胞增殖的测定

当来源于中腔卵泡或小腔卵泡的原代卵丘细胞生长到80%，同时将二者消化重悬，将细胞浓度调整为 2×10个/mL，接种于96孔板内，每孔接种100 μL。利用CCK-8试剂盒处理细胞，在培养箱内37 ℃孵育2 h后，利用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，按平均吸光度数值与细胞增殖成正比。

细胞培养液中葡萄糖消耗检测

收集培养液，按照说明书加入相应试剂，充分混匀，37 ℃水浴中孵育10 min，使用酶标仪测定505 nm波长吸光度，读取标准孔、测定孔的吸光度，分别为A标准、A 样本。培养液中葡萄糖浓度=A测定/A标准×标准液浓度。原培养液中葡萄糖浓度-检测培养液中葡萄糖浓度=消耗葡萄糖浓度。

乳酸生成检测

收集培养液，按照说明书加入样本、酶工作液、显色剂，混匀，准确计时，37 ℃水浴10 min，使用酶标仪测定530 nm 波长吸光度，培养液中乳酸浓度=校准液浓度×(样本吸光度值-空白吸光度值)/(校准吸光度值-空白吸光度值)。检测培养液中乳酸浓度-原培养液中乳酸浓度=乳酸生成浓度。

培养液或卵母细胞中NADPH含量检测

收集培养液或卵母细胞，按照试剂盒说明书加入碱性提取液，(细胞需超声波破碎1 min)，95 ℃水浴5 min。冰浴冷却后，10 000 g 4 ℃离心10 min，取上清至新管中，加入等体积的酸性提取液。混匀，10 000 g 4 ℃离心10 min，取上清于冰上待测。根据试剂盒说明依序加入试剂，使用酶标仪测定570 nm波长吸光值。

细胞内ATP含量测定

根据ATP检测试剂盒说明书进行操作，使用ATP裂解液裂解细胞,12 000 r/min离心5 min,收集上清用于后续测定。加100 μL ATP检测工作液到检测孔内。室温放置3～5 min。然后在检测孔内加上20 μL样品或标准品，使用酶标仪测定RLU值，依据标准曲线计算每孔细胞内ATP含量。

表1 试验设计分组信息
Table 1 Group information of experimental design

序号No.试验对象Test subjects各组细胞数量Numberof cells ineach group添加物质Addedsubstances分组信息Group information检测指标Test index1分离的卵丘细胞分离自50个COCs无中、小腔卵泡卵丘细胞G6PDH、PFKL和PFKM表达量细胞增殖2分离的卵丘细胞分离自50个COCsAREG、DOs、GDF9、BMP15①中、小腔卵泡卵丘细胞体外培养分别添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG。②中、小腔卵泡卵丘细胞体外培养添加或不添加10 ng/mL AREG、0.5个/μL DOs、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。细胞增殖3分离的卵丘细胞分离自50个COCsAREG、GDF9、BMP15中、小腔卵泡卵丘细胞体外培养添加或不添加10 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15。培养液中的葡萄糖消耗培养液中的乳酸生成培养液中的NADPH卵丘细胞内的ATP4COCs(以COCs的结构进行卵母细胞IVM)60个COCsAREG、GDF9、BMP15小腔卵泡卵母细胞IVM培养液添加或不添加100 ng/mL AREG、100 ng/mL GDF9和100 ng/mL BMP15,中腔卵泡卵母细胞IVM培养液不添加上述物质。培养液中的葡萄糖消耗培养液中的乳酸生成卵母细胞内的NADPH卵丘细胞内的ATP卵母细胞内的ATP

表2 RT-PCR引物序列
Table 2 The sequence of primers used for RT-PCR

基因Gene引物序列(5′-3′)Primer sequence (5′-3′)退火温度/℃Annealing temperatureG6PDHF: TGACCTATGGCAACCGATACAAR: CCGCAAAAGACATCCAGGAT60PFKMF: ATCCCTGCCACGGTCTCCAAR: TGCCGCTGACTGCTTGATGC60PFKLF: TTCGTGCTGGAGGTGATGGGR: CTCCCAGCCGTCCTCAGGTG60YWHAZF: TGTAGGAGCCCGTAGGTCATCTR:TTCTCTCTGTATTCTCGAGCCATCT60

数据的统计分析所有试验重复3次，结果表示为平均值±标准差，使用SAS 9.2软件进行统计分析，采用GLM方差分析事后Tukey检验进行分析。

<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达量及细胞增殖能力的比较

检测中、小腔卵泡卵丘细胞中PPP相关基因

G6PDH

和糖酵解相关基因

PFKL

和

PFKM

的表达量。如图1所示，

G6PDH

、

PFKL

和

PFKM

在小腔卵泡卵丘细胞的mRNA表达量均显著低于中腔卵泡卵丘细胞(0.905±0.036和1.105±0.038、0.751±0.047和1.334±0.052、0.806±0.025 和1.241±0.046，

<0.05)；来源于中腔卵泡和小腔卵泡的第二代卵丘细胞生长曲线均近似“S”型，中腔卵泡卵丘细胞在前5 d(120 h)的增殖能力显著高于小腔卵泡卵丘细胞(

<0.05)，且在第2天(48 h)差距最大。这些结果说明相比于中腔卵泡卵丘细胞，小腔卵泡卵丘细胞的葡萄糖代谢能力及细胞增殖能力较弱。

(a)G6PDH、PFKL和PFKM在中、小腔卵泡卵丘细胞中的表达丰度；(b)中、小腔卵泡卵丘细胞的生长曲线；*表示显著差异，P<0.05。(a) Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from medium and small antral follicles. (b) Growth curve of cumulus cells from medium and small antral follicles. *indicate significant difference (P<0.05).图1 中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达量及细胞增值能力的比较Fig.1 Expression abundance of G6PDH、PFKL and PFKM in cumulus cells from different diameter antral follicles of sheep

2.2 AREG及OSFs对中、小腔卵泡卵丘细胞增殖的影响

在第二代卵丘细胞培养24 h后，添加0、5、10、50、100 ng/mL AREG，孵育24 h后检测细胞增殖。如图2(a)所示，与不添加AREG组相比，10、50 和100 ng/mL AREG显著提高中腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(0.633±0.009、0.689±0.015、0.691±0.011 和0.692±0.016，

<0.05)，50和100 ng/mL AREG显著提高小腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(0.400±0.003、0.436±0.006和0.445±0.007，

<0.05)，但仍显著低于所有浓度组的中腔卵泡卵丘细胞(

<0.05)。推测AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞增殖影响的差异，是因为小腔卵泡卵丘细胞上EGFR表达较低。在第二代卵丘细胞培养24 h后，添加10 ng/mL AREG，添加或不添加DOs(提供卵源性OSFs)和GDF9+BMP15，孵育24 h后检测细胞增殖能力。结果如图2(b)所示，添加DOs而不添加AREG，小腔卵泡卵丘细胞的增殖显著低于中腔卵泡卵丘细胞(0.667±0.018和0.731±0.011，

<0.05)；添加DOs和AREG后，中、小腔卵泡卵丘细胞的增殖显著提高(0.786±0.007和0.778±0.022，

<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘细胞的增殖无显著差异(

>0.05)；添加AREG和GDF9+BMP15培养的中、小腔卵泡卵丘细胞，增殖能力均显著高于添加AREG和DOs，且两者间差异不显著(

>0.05)。这说明在满足OSFs及AREG的条件下，中、小腔卵泡卵丘细胞的增殖能力可以达到相同的水平，且GDF9和BMP15代表OSFs发挥协同的作用。

(a)不同浓度AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞增殖的影响；(b)在OSFs作用下，10 ng/mL AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞增殖的影响；G9：GDF9；B15：BMP15；不同的字母表示显著差异，P<0.05。(a) The effect of different concentrations of AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells. (b) The effect of 10 ng/mL AREG on the proliferation of medium and small antral follicle cumulus cells under the effect of OSFs. G9: GDF9, B15: BMP15. Different letters indicate significant difference (P<0.05).图2 AREG及OSFs对不同直径卵泡的卵丘细胞增殖的影响Fig.2 Effects of AREG and OSFs on the proliferation of cumulus cells from different diameter antral follicles

2.3 在GDF9和BMP15的协同作用下，AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

在第二代卵丘细胞培养24 h后，在添加GDF9+BMP15的基础上添加或不添加10 ng/mL AREG，培养24 h。检测培养液中葡萄糖的消耗以及乳酸、NADPH的生成，检测卵丘细胞中ATP的含量。结果如图3所示，在不添加AREG的条件下，中腔卵泡卵丘细胞培养液中的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘细胞内ATP含量显著高于小腔卵泡卵丘细胞(1.000±0.092和0.790±0.065、1.000±0.107和0.250±0.058、1.000±0.047和0.797±0.068、1.000±0.023和0.790±0.042，

<0.05)，添加AREG显著增加中、小腔卵泡卵丘细胞的葡萄糖消耗、NADPH生成、乳酸生成及卵丘细胞内ATP含量(1.425±0.051 和1.296±0.049、1.661±0.071和1.393±0.107、1.443±0.048和1.307±0.063、1.209±0.031 和1.099±0.04，P<0.05)，且中、小腔卵泡卵丘细胞之间差异显著(

<0.05)。这说明在GDF9和BMP15的协同作用下，AREG可以增强中、小腔卵泡卵丘细胞的葡萄糖代谢能力，但添加AREG、GDF9和BMP15后的小腔卵泡卵丘细胞的葡萄糖代谢相对小腔卵泡较低，也进一步证明两者葡萄糖代谢能力的差异。

2.4 IVM培养液中添加AREG、GDF9和BMP15可以增强小腔卵泡COCs的葡萄糖代谢

(a)培养液中葡萄糖的消耗；(b)培养液中乳酸的生成；(c)培养液中NADPH的生成；(d)卵丘细胞中ATP的含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各图中不添加AREG的中腔卵泡组值标记为1，其他各组平均值为该值的相对值，不同的字母表示显著差异，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH production in culture solution; (d) Relative ATP concentration in cumulus cells. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group without AREG was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).图3 在GDF9和BMP15的协同作用下，AREG对中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢的影响Fig.3 Effects of AREG on the glucose metabolism of cumulus cells from different diameter antral follicles under the synergistic effect of GDF9 and BMP15

为了在IVM过程中使小腔卵泡COCs的葡萄糖代谢提升到中腔卵泡水平，在小腔卵泡卵母细胞IVM培养液中添加AREG、GDF9和BMP15，检测IVM后培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成以及卵母细胞中的NADPH含量。如图4所示，与对照组相比，添加AREG、GDF9和BMP15显著提高了小腔卵泡COCs的葡萄糖消耗、乳酸生成和卵母细胞中的NADPH含量(1.177±0.007和0.169±0.05、1.171±0.091和0.167±0.055、0.984±0.037 和0.846±0.017，

<0.05)。另外，添加AREG、GDF9和BMP15的小腔卵泡COCs葡萄糖消耗、乳酸生成显著高于中腔卵泡COCs(1.177±0.007和1.000±0.07、1.171±0.091和1.000±0.039、0.984±0.037和1.000±0.020，

<0.05)，卵母细胞NADPH含量与中腔卵泡卵母细胞差异不显著(

>0.05)。检测IVM后卵丘细胞以及卵母细胞中的ATP含量，如图5所示，与对照组相比，添加AREG、GDF9和BMP15显著增强小腔卵泡卵丘细胞及卵母细胞内的ATP含量(1.102±0.011 和0.629±0.127、0.991±0.026和0.721±0.022，

<0.05；与中腔卵泡组相比，卵丘细胞内ATP含量显著高于(1.102±0.011和1.000±0.018，

<0.05)中腔卵泡卵丘细胞，卵母细胞内ATP含量与中腔卵泡卵母细胞差异不显著(0.991±0.026和1.000±0.011，

>0.05)。这说明AREG+GDF9+BMP15可以在IVM中提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代谢水平。

3 讨论

近年来，许多的研究发现AREG作为一种EGF类因子，可以激活卵丘细胞上的EGFR信号通路，促进卵母细胞的成熟，卵母细胞分泌的OSFs也起到协同作用。Sugimura等在猪发育能力较低的小腔卵泡卵母细胞上的研究上也发现相同结果。不同直径腔卵泡卵母细胞的发育能力存在差异，不仅是卵母细胞自身的问题，也受其周围卵丘细胞的调控，而不同直径腔卵泡卵丘细胞的信号转导存在着差异。例如，小腔卵泡卵丘细胞的EGFR表达较低。分离培养不同直径腔卵泡的卵丘细胞，可以排除卵母细胞的影响。因此本实验以分离的不同直径腔卵泡卵丘细胞为研究对象，探究他们之间的增殖代谢差异，可以帮助我们理解卵母细胞成熟的机制。

卵丘细胞的增殖能力，是细胞的重要生理功能之一，是其代谢及信号转导功能的体现。本研究结果显示，小腔卵泡卵丘细胞的糖酵解途径及PPP相关基因表达量较低，表明其对葡萄糖代谢的能力较低。这可能与小腔卵泡卵丘细胞上EFGR信号通路较弱有关，也与Wigglesworth等在小鼠不同直径卵泡上的研究结果一致。卵丘细胞主要通过糖酵解产生ATP供给其各项生命活动，并产生代谢产物如丙酮酸和乳酸。卵丘细胞还要通过PPP代谢葡萄糖产生NADPH，以维持细胞内的氧化还原平衡。所以小腔卵泡卵丘上较低的葡萄糖代谢可能会影响其增殖能力。丙酮酸和NADPH的供给对于卵母细胞ATP的合成及成熟至关重要，ATP含量较高的卵母细胞具有更高的受精率和囊胚发育率。另外，在检测IVM过程中卵丘细胞PPP的强弱时，本研究测定了卵母细胞内的NADPH含量而不是培养液中的NAPDH生成，是因为在COCs中卵丘细胞产生的NADPH需要通过GJC传递给卵母细胞。

(a)培养液中葡萄的消耗；(b)培养液中乳酸的生成；(c)卵母细胞中NADPH的含量。G9：GDF9；B15：BMP15。在各图中腔卵泡组的值标记为1，其他各组平均值为该值的相对值。不同字母上标表示显著差异，P<0.05。(a) Relative glucose uptake in culture solution; (b) Relative lactate production in culture solution; (c) Relative NADPH concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).图4 AREG、GDF9和BMP15对小腔卵泡COCs葡萄糖代谢的影响Fig.4 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on glucose metabolism of COCs from small antral follicles

(a)卵丘细胞内ATP 含量；(b)卵母细胞内ATP含量；G9：GDF9；B15：BMP15；在各图中腔卵泡组的值标记为1，其他各组平均值为该值的相对值；不同字母上标表示显著差异，P<0.05。(a) ATP concentration in cumulus cells; (b) ATP concentration in oocytes. G9: GDF9; B15: BMP15. Within each graph, the medium group was assigned a value of one and all other means are expressed relative to this value. Different letters indicate significant difference (P<0.05).图5 AREG、GDF9和BMP15对小腔卵泡卵丘及卵母细胞内ATP含量的影响Fig.5 Effects of AREG, GDF9 and BMP15 on cumulus cells and oocytes ATP concentration from small antral follicular COCs

对来源于不同直径腔卵泡卵丘细胞添加了不同浓度的AREG，发现小腔卵泡卵丘细胞对AREG的敏感度较低，需要较大的浓度才能提高其增殖能力，但还与中等腔卵泡卵丘细胞有较大的差距。可能相对于中腔卵泡卵丘细胞，小腔卵泡卵丘细胞没有得到OSFs的足够刺激。由于不同直径腔卵泡中的卵母细胞发育程度不同，OSFs水平也存在较大差异，例如小腔卵泡卵母细胞的GDF9和BMP15表达较低。本研究在不同直径腔卵泡卵丘细胞培养液中同时添加了来自与中腔卵泡的卵母细胞，保证相同的OSFs供应。结果发现，在GDF9和BMP15的协同作用下，AREG可以增强不同直径腔卵泡卵丘细胞的增殖及葡萄糖代谢能力，且在一定程度上可以缩小中、小腔卵泡卵丘细胞的差距。小腔卵泡卵丘细胞的葡萄糖代谢能力与中腔卵泡卵丘细胞还有一定的差距，可能是因为相同剂量的AREG和OSFs对小腔卵泡卵丘上的EGFR信号刺激还不够。

本课题组之前的研究发现，在小腔卵泡卵母细胞IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15，可以显著提高卵母细胞的能量代谢水平及IVF后的胚胎发育能力。在本研究中，发现添加AREG+GDF9+BMP15显著增强小腔卵泡COCs的葡萄糖代谢能力，并且高于中腔卵泡的水平，这可能是因为外源添加的AREG+GDF9+BMP15充分增强了小腔卵泡卵丘细胞上的EGFR信号通路，由此也增强了小腔卵泡卵丘细胞向卵母细胞传递代谢物并产生ATP的能力。

4 结论

本研究表明，在GDF9和BMP15的协同作用下，AREG可以增强不同直径腔卵泡卵丘细胞的增殖及葡萄糖代谢能力，在IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15可以提高小腔卵泡COCs的葡萄糖代谢水平。本研究改善了绵羊小腔卵泡卵母细胞的IVM质量，从而提高了绵羊卵母细胞的利用效率。本研究为家畜动物卵泡发育的研究奠定基础，说明了AREG对卵丘细胞葡萄糖代谢的作用，而卵丘细胞的EGFR信号转导对其葡萄糖代谢的影响机制还有待进一步研究。