尹建雯，贾森泉，周永明，古文鹏，赵智娴

(云南省疾病预防控制中心 急性传染病防制所，云南 昆明 650022)

沙门氏菌是全球范围内报道最多，各国公认的食源性疾病所致感染性腹泻的首要致病菌[1]，血清型种类繁多，其中鼠伤寒沙门氏菌属于常见血清型之一，广泛存在于自然环境和人类食物饮用水中，可引起食物中毒，造成不同程度肠炎疾病[2，3]，是引起食源性疾病暴发的优势血清型。抗生素的使用对细菌感染起到良好的治疗作用，但是也导致大量耐药菌株，甚至是多重耐药包括碳青霉烯酶耐药、超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrum β-lactamase，ESBLs)耐药，使得抗生素的使用范围越来越窄。鼠伤寒沙门氏菌的临床耐药情况不容忽视[4]。本研究从健康服务从业人员的肛拭标本中分离出的鼠伤寒沙门氏菌中筛选出ESBLs的菌株，再进行耐药分析及脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分析，了解鼠伤寒沙门菌的耐药情况，为鼠伤寒沙门氏菌的监测提供参考。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

挑选2016—2018年某区健康服务从业人员体检肛拭标本，共60533份(其中2016年15321份。2017年17618份，2018年27594份，共检出鼠伤寒沙门氏菌68株，其中产ESBLs的6株。

1.1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)仪、PFGE、凝胶成像仪。

磺胺增菌液、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂、三糖铁琼脂，全自动生化革兰氏阴性菌[(Gram-negative，GN)鉴定卡(简称GN卡)]、沙门菌诊断血清、ESBLs选择培养基、沙门氏菌诊断血清、限制性内切酶XbaⅠ(TAKARA)、蛋白酶K(Merck)、Seakem Gold Agarose(LONZA)、Tris-Hcl(SolarBio)、EDTA(SolarBio)、TBE(SolarBio)、Gelred(biotium)，PCR Mix(TAKARA)、琼脂糖(Bio-Rad)、DNA Marker2000(TAKARA)、革兰氏阴性需氧菌药敏检测板，均在有效期内使用。抗生素药敏检测板包括：氨苄青霉素(Ampicillin，AMP)、氨苄西林-舒巴坦(Ampicillin Sodium and Sulbactam Sodium，AMS)、四环素(Tetracyclines，TET)、氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、复方新诺明(Sulfamethoxazole，SMZ)、头孢唑林(Cefazolin，CFZ)、头孢噻肟(Cefotaxime，CTX)、头孢他啶(Cazpentahydrate，CAZ)、头孢西丁(Cefoxitin，CFX)、庆大霉素(Gentamycin，GEN)、亚胺培南(Imipenem，IMI)、萘啶酸(Nalidixic Acid，NAL)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)、磺胺异噁唑(Sulfisoxazole，Sul)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿莫西林-克拉维酸(Amoxicillin and Clavulanate，AMC)、头孢噻肟-克拉维酸(CefotaximeSodiumsalt-Claforan，CTX-C)、头孢他啶-克拉维酸(Cazpentahydrate-Claforan，CAZ-C)、多黏菌素B(Polymyxin B，PB)、多黏菌素E(Colistin，CT)、米诺环素(Minocycline，MIN)、阿米卡星(Amiklin，AMI)、氨曲南(Aztreonam，AZM)、美罗培南(Meropenem，MEM)、头孢吡肟(Cefepime，CAS)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)、多西环素(Doxycycline，DOX)、卡那霉素(Kanamycin，KAN)、链霉素(Streptomycin，STR)、吉米沙星(Gemifloxacin，GEM)。PCR引物为某公司合成，引物序列见表1。

表1 耐药基因引物序列及目的片段、退火温度

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离鉴定

参照GB/T 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》[5]和WS 280-2008《伤寒和副伤寒诊断标准》[6]进行沙门菌检验。从业人员肛拭标本用SBG肉汤36 ℃增菌18～24 h；取增菌液分别划线至XLD，36 ℃培养18～24 h，挑取可疑菌落转种于三糖铁斜面，36 ℃培养18～24 h，生化符合的进行全自动细菌生化系统鉴定，鉴定卡为GN卡。经生化鉴定为沙门菌的进行血清分型鉴定。典型鼠伤寒沙门菌血清型为1，4，5，12 ∶i ∶1，2[7]。鉴定为鼠伤寒沙门菌的接种于ESBLs耐药培养基，挑取生长的菌株进行以下的实验。

1.2.2 耐药基因鉴定

采用DNA提取试剂盒提取基因组为模版，严格按照试剂盒说明书操作，PCR转录完成后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。产物由某生物工程技术服务有限公司测序。测序结果采用相关软件进行编辑处理，随后在采用BLAST程序在GenBank数据库中进行比对，获得准确的ESBLs基因型别。

1.2.3 药敏试验

挑取对数生长期的纯菌落加入生理盐水稀释管中混匀，调整菌悬液浓度至0.5 McF，取60 μL菌悬液至肉汤接种管中，使用全自动菌液接种仪加入96孔药敏板中，每孔100 μL，阴性对照孔加无菌营养肉汤培养液100 μL。将药敏板放入恒温培养箱中37 ℃培养18～20 h后判读结果。以大肠埃希菌(ATCC 25922)作为质控菌株。根据美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的相应标准获得相应敏感(Susceptible，S)、中度敏感(Intermediate，I)和耐药(Resistant，R)的结果。

1.2.4 PFGE分型

按照PulseNet沙门菌PFGE的标准方法[8]，用Sea Kem glod agarose包埋，蛋白酶K裂解，Xba I酶切，所得DNA片段用Chef-mapper进行脉冲场凝胶电泳分型，PFGE后染色，用凝胶成像系统获得图谱，Marker为H9812，与从腹泻病例中分离到的两株鼠伤寒沙门氏菌A、B比较。

2 结果

2.1 耐药基因检测结果

6株鼠伤寒沙门氏菌耐药基因PCR检测，5株检出blaCTX-M-14和blaTEM-1，1株只检出blaTEM-1，其余基因未检出。

2.2 药敏结果

6株鼠伤寒沙门氏菌均为多重耐药菌，均对氨苄青霉素、氨苄青霉素/复方新诺明、四环素、头孢唑林、头孢噻肟、磺胺异噁唑、米诺环素、氨曲南、头孢吡肟、多西环素、链霉素产生耐药，耐药率100%，耐药谱显示菌株间耐药情况均不相同，见表2。

表2 6株鼠伤寒沙门菌耐药谱

2.3 PFGE结果

所检6株鼠伤寒沙门氏菌经限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳后，产生12～18条大小不同的片段(见图1)，为不同带型，且与从腹泻病例中分离到的两株鼠伤寒沙门氏菌A、B比较，带型也不同。

图1 6株鼠伤寒沙门氏菌PFGE结果注：M：H9812；A、B：为腹泻标本检出的鼠伤寒沙门氏菌

3 讨论

细菌感染治疗与防控的过程中，抗生素的使用具有重要意义。1980年第三代头孢菌素的使用对β-内酰胺酶介导的耐药细菌治疗效果显著，然后随着药物的使用，β-内酰胺酶在某些特定物种(大肠埃希菌)大量表达引起抗性，并且这些耐药抗性在不同种细菌间进行传播[9，10]。ESBLs能够水解青霉素类抗生素、头孢菌素(主要为第三代头孢菌素，如头孢他啶、头孢哌酮等)和单环β-内酰胺类抗生素(氨曲南、卡芦莫南等)，从而使细菌产生多重耐药。ESBLs基因型主要为TEM、CTX-M、SHV、OXA，成全球分布，可由质粒携带，可通过融合、转导和转化等机制进行细菌间传播转移，从而扩大爆发，我国患者中临床流行主要为CTX-M[11]。本研究中鼠伤寒的检出率不高，仅为0.056%，但产ESBLs的菌株就占了17.6%，产ESBLs的菌株在鼠伤寒沙门氏菌中比例非常之高。6株菌中5株鼠伤寒沙门氏菌中均检出CTX-M-14和TEM-1，表明本地耐药基因以CTX-M-14和TEM-1为主。与曲梅等[12]关于北京地区沙门氏菌耐药基因以TEM-1为主，CTX-M为辅的结果相似。6株鼠伤寒沙门菌均为耐12种以上抗菌药物的多重耐药菌，对氨苄青霉素、氨苄青霉素/复方新诺明、四环素、头孢唑林、头孢噻肟、磺胺异噁唑、米诺环素、氨曲南、头孢吡肟、多西环素、链霉素产生耐药，只有一株对氯霉素敏感，其余均耐药，这与田云萍等[13]研究的云南本地鼠伤寒沙门菌耐药情况不同，出现了耐更多药的鼠伤寒沙门菌，说明本地耐药情况呈多样性。

PFGE分子分型技术是细菌分子分型同源性分析的有效方法，是国际认证的对爆发株区分和溯源的金标准[8]。本次试验将分离得到的6株产ESBLs鼠伤寒沙门菌进行PFGE分型，并与腹泻病例中分离到的鼠伤寒沙门菌做对比，显示健康人群携带的鼠伤寒沙门菌都具有不同的带型，且与腹泻病例菌株存在差异，说明本地区鼠伤寒沙门菌存在多样性。

本研究收集了健康服务从业人员体检人群的肛拭标本进行耐药菌研究，并获得产超广谱β-内酰胺酶的鼠伤寒沙门菌，获得的6株菌均为耐12种以上抗菌药物的多重耐药菌，这与游兴勇等[14]关于餐饮人员带菌调查中出现的结果相识，说明健康人群中携带鼠伤寒沙门氏菌和多重耐药的情况不容忽视。近年鼠伤寒沙门菌引起的感染多以散发形式报告，经分子分型研究，发现散发病例都有一定的聚集倾向[15]，但因缺乏流行病学信息，不能准确溯源。因此开展健康服务从业人员携带沙门氏菌监测，及时监控饮食卫生，开展预警，防止鼠伤寒沙门氏菌感染发生，对健康服务行业具有重要意义，同时也对沙门菌分布和耐药传递调查具有重要意义。