稀硫酸预处理泥炭酶解发酵产乙醇研究

2022-10-19李丽萍马力通杨世波

化学与生物工程 2022年10期

李丽萍，马力通,2*，杨世波

(1.内蒙古科技大学化学与化工学院，内蒙古包头 014010；2.生物煤化工综合利用内蒙古自治区工程研究中心，内蒙古包头 014010)

淀粉质原料[1]、糖蜜原料[2]已广泛用于制备生物乙醇，以木质纤维素为原料的第二代生物乙醇对实现碳中和目标具有重要意义[3-4]。草本泥炭由多种草本植物残体组成，含有丰富的纤维素、半纤维素，适合于生物乙醇的制备。张学才等[5]对酸法水解泥炭工艺及其水解液发酵制乙醇及单细胞蛋白进行了研究，发现酵母在泥炭水解液配制的培养基中繁殖力很强，且发酵滤液中含有乙醇。

目前，我国的泥炭矿床类型主要以富营养草本泥炭为主，木本泥炭为辅，藓类泥炭次之[6]，常被用作园艺基质[7]和有机肥料[8]。路亚楠等[9]研究发现，酸预处理能使泥炭的比表面积显著增大、孔隙率提高，适合微生物定殖；李珺等[10]研究发现，稀硫酸预处理泥炭能降解1.17%纤维素、4.44%半纤维素及9.37%木质素；黄俊等[11]研究发现，糖化发酵是木质纤维素生产燃料乙醇的关键步骤，对乙醇产量起决定性作用。在此，作者将草本泥炭用稀硫酸预处理后，经纤维素酶酶解、酵母发酵产乙醇，通过单因素实验和正交实验优化发酵工艺，拟为乙醇生产提供新途径。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

草本泥炭，取自吉林；耐高温酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

K2Cr2O7、乙醇、硫酸、C6H12O6，分析纯，天津化学试剂三厂。

高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV765型紫外可见分光光度计，上海精科。

1.2 草本泥炭酶解发酵产乙醇

将草本泥炭粉碎，过100目筛；称取草本泥炭粉末10.0 g，按固液比1∶5(g∶mL)加入5%稀硫酸于锥形瓶中，密封后置于100 ℃水浴中加热120 min，取出冷却至室温；调节pH值至4.8，加入纤维素酶3.0 g，于50 ℃下磁力搅拌8 h，然后迅速置于沸水浴中使纤维素酶失活，即得酶解液；调节酶解液pH值，加入一定量的耐高温酿酒酵母，充分搅拌后，置于一定温度水浴中发酵一定时间，采用紫外可见分光光度计测定发酵液在600 nm处吸光度，根据乙醇标准曲线计算乙醇体积，按下式计算酒精度(100 mL溶液中乙醇的体积，%vol)。本实验用酒精度反映草本泥炭酶解发酵产乙醇的效率。

式中：V0为根据标准曲线计算得到的乙醇体积，mL；c为乙醇标准溶液浓度，此处为0.02 g·mL-1；V为样品溶液的体积，mL；V1为样品溶液稀释后的体积，mL；ρ为20 ℃时乙醇密度，此处为0.79 g·mL-1。

1.3 发酵工艺优化

1.3.1 单因素实验

采用单因素实验分别考察酵母加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、发酵液pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、发酵温度(34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃)、发酵时间(48 h、54 h、60 h、66 h、72 h)对草本泥炭发酵产乙醇的影响。

1.3.2 正交实验

在单因素实验的基础上，选择酵母加量、发酵液pH值、发酵温度、发酵时间为考察因素，以酒精度为评价指标，进行L9(34)正交实验进一步优化草本泥炭发酵产乙醇工艺，每组实验做3个平行。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酵母加量对草本泥炭发酵产乙醇的影响

在发酵液pH值为4.0、发酵温度为40 ℃、发酵时间为48 h的条件下，考察酵母加量对酒精度的影响，结果如图1所示。

图1 酵母加量对酒精度的影响Fig.1 Effect of yeast dosage on alcoholicity

在发酵过程中，酵母可以将发酵液中的还原糖转化为乙醇[12]。由图1可知，随着酵母加量的增加，酒精度先升高后降低；当酵母加量为0.05%时，酒精度为1.86%vol，此时酵母不能充分利用发酵液中的糖分，即对草本泥炭的利用率较低；当酵母加量增至0.15%时，酒精度达到最高，为2.42%vol；当酵母加量继续增至0.25%时，酒精度降至1.99%vol，这是由于，过量的酵母会导致菌种老化[13]。因此，酵母加量以0.15%较为适宜。

2.1.2 发酵液pH值对草本泥炭发酵产乙醇的影响

在酵母加量为0.15%、发酵温度为40 ℃、发酵时间为48 h的条件下，考察发酵液pH值对酒精度的影响，结果如图2所示。

图2 发酵液pH值对酒精度的影响Fig.2 Effect of pH value of fermentation broth on alcoholicity

在发酵过程中，适宜的pH值有助于酵母的繁殖[14]。由图2可知，随着发酵液pH值的增大，酒精度逐渐降低；当发酵液pH值为4.0时，酒精度最高，为2.87%vol；当发酵液pH值为6.0时，酒精度降至2.01%vol。表明当酸性环境逐渐减弱时，过高的发酵液pH值会使酵母活性降低，不利于乙醇的合成[15]。因此，发酵液pH值以4.0较为适宜。

2.1.3 发酵温度对草本泥炭发酵产乙醇的影响

在酵母加量为0.15%、发酵液pH值为4.0、发酵时间为48 h的条件下，考察发酵温度对酒精度的影响，结果如图3所示。

图3 发酵温度对酒精度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcoholicity

发酵温度是发酵过程中最重要的影响因素，温度过低不利于酵母的繁殖，温度过高会导致酵母死亡[16]。由图3可知，随着发酵温度的升高，酒精度呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为38 ℃时，酒精度达到最高，为3.14%vol；当发酵温度升至42 ℃时，酒精度迅速降至2.64%vol。这是由于，较高的发酵温度使酵母细胞活力下降，导致还原糖利用不完全，乙醇产量降低[17]。因此，发酵温度控制在38 ℃较为适宜。

2.1.4 发酵时间对草本泥炭发酵产乙醇的影响

在酵母加量为0.15%、发酵液pH值为4.0、发酵温度为38 ℃的条件下，考察发酵时间对酒精度的影响，结果如图4所示。

图4 发酵时间对酒精度的影响Fig.4 Effect of fermentation time on alcoholicity

由图4可知，随着发酵时间的延长，酒精度先迅速升高后缓慢降低；当发酵时间为48 h时，发酵未完成，酒精度为2.97%vol；当发酵时间延长至60 h时，酒精度达到最高，为3.62%vol；继续延长发酵时间至72 h时，酒精度降至3.39%vol。这是由于，发酵时间过长，杂菌形成优势菌群，不利于酵母的繁殖[18]，且部分乙醇转化为酯类物质，导致酒精度降低[19]。因此，发酵时间控制在60 h较为适宜。