关 丽，赵惠茹，高 璐，唐潇潇，李伟泽*，赵 宁，冯 锋

(1.西安医学院药学院，陕西 西安 710021；2.中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198)

肿瘤的生长和转移高度依赖于血管新生，通过血管新生获得生长所需要的营养，并通过新生血管转移到其它组织和器官。因此，开发血管新生抑制剂成为抗肿瘤研究的主要途径[1-4]。

近年来，斑马鱼体内化学筛选已成为研究血管新生抑制剂和鉴定先导化合物的理想方法[5-9]。斑马鱼在受精后24 h(24 hpf)左右开始发育形成血管组织，转基因斑马鱼因为基因改造在胚胎和幼虫发育过程中表现出增强的绿色荧光蛋白(EGFP)的血管系统特异性表达，其内皮细胞可稳定表达绿色荧光蛋白，因此，通过追踪绿色荧光蛋白的表达，可以判断血管组织的分布和完整性。与野生型斑马鱼相比，转基因斑马鱼可以提供更高的血管系统分辨率，且处理过程简单、快速，便于观察，从而可以快速分析活胚胎对药物[10]的反应。因此，转基因斑马鱼可直接作为血管新生抑制剂的筛选模型。

前期研究发现，4-羟基-3,5,2′-三甲氧基联苄(Aw)有明显的抗肿瘤作用。基于此，作者以4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛为原料，以Wittig反应为关键步骤，通过7步反应高效合成目标化合物Aw；采用转基因斑马鱼模型研究目标化合物Aw的抑制血管新生活性。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

硅胶GF254薄层板，青岛海洋化工厂；转基因斑马鱼Tg(fli-1:EGFP)，南京大学模型动物研究中心。

柱色谱硅胶，上海谱振生物科技有限公司；DMSO，国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均购于阿拉丁。

AVANCE-300MHz型核磁共振波谱仪，Bruker；1100 Series型ESI-MS质谱仪，美国Agilent；二氧化碳培养箱，Thermo；TR6000型全自动酶标仪，深圳雷杜。

1.2 合成方法

以4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛(Ⅰ)为原料，与乙酸酐反应得到乙酰基保护产物Ⅱ，再经NaBH4还原醛基暴露出醇羟基得到化合物Ⅲ，化合物Ⅲ的羟基与二氯亚砜反应得到卤代产物Ⅳ，然后与三苯基膦反应得到关键中间体膦叶立德Ⅴ[11-12]，化合物Ⅴ与2-甲氧基苯甲醛缩合得到3,5,2′-三甲氧基二苯乙烯衍生物Ⅵ，最后化合物Ⅵ通过氢化反应和脱乙酰基反应得到目标化合物Aw。合成路线如图1所示。

图1 目标化合物Aw的合成路线Fig.1 Synthetic route of target compound Aw

1.2.1 4-甲酰基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅱ)的合成

取4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛(3.0 g,16.5 mmol)置于茄型瓶中， 加入催化剂量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，用二氯甲烷(DCM,10 mL)溶解，缓慢滴加乙酸酐(1.60 mL,18.2 mmol)，常温搅拌1 h；点板监测反应结束，溶液用蒸馏水萃取3次(3×10 mL)；有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，得白色晶体化合物Ⅱ3.66 g，产率99.5%。

1.2.2 4-羟甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅲ)的合成

取化合物Ⅱ(3.0 g,13.3 mmol)置于茄型瓶中，用10 mL乙醇溶解，冰盐浴下缓慢加入硼氢化钠(0.53 g,14.0 mmol)，室温搅拌1 h后加入5%HCl调节pH值至7；减压浓缩，残渣用二氯甲烷萃取3次(3×10 mL)；有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，得白色固体化合物Ⅲ 2.92 g，产率96.5%。

1.2.3 4-氯甲基-2,6-二甲氧基苯基乙酸酯(Ⅳ)的合成

取化合物Ⅲ(2.9 g,12.9 mmol)置于茄型瓶中，用二氯甲烷(10 mL)溶解，冰盐浴下先加入三乙胺(3.7 mL,25.8 mmol)，再缓慢滴加二氯亚砜(1.8 mL,25.8 mmol)，室温搅拌3 h；溶液用蒸馏水萃取3次(3×10 mL)；有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩，得亮黄色固体化合物Ⅳ 2.76 g，产率88.1%。

1.2.4 (4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯基)三苯基甲基氯化膦(Ⅴ)的合成

取化合物Ⅳ(2.5 g,10.2 mmol)和三苯基膦(2.68 g,10.2 mmol)置于100 mL茄型瓶中，用少量甲苯(5 mL)溶解，加热回流6 h，析出大量白色粉末；冷却至室温，减压抽滤，得白色粉末化合物Ⅴ 4.73 g，产率91.3%。

1.2.5 4-羟基-3,5,2′-三甲氧基联苄(Aw)的合成

取化合物Ⅴ(500 mg,0.99 mmol)和2-甲氧基苯甲醛(134.6 mg,0.99 mmol)在氩气保护下溶解于无水四氢呋喃(3 mL)中，冰盐浴下缓慢加入氢化钠(28.4 mg,1.18 mmol)，室温反应过夜后浓缩；然后将反式和顺式二苯乙烯的混合物在甲醇中重结晶，用15 mL乙酸乙酯溶解，加入30 mg 10%Pd/C，通氢气下搅拌反应，反应毕过滤去除Pd/C，用少量甲醇洗涤；最后反应混合物在乙醇溶液中加入甲醇钠以去除乙酰基，用硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯为洗脱液，体积比10∶1)纯化，得黄色固体目标化合物Aw，产率42%。

1.3 抑制血管新生活性研究

采用在体转基因斑马鱼实验评价目标化合物Aw对转基因斑马鱼体型及体节间血管的影响。在72 hpf，取转基因斑马鱼正常发育胚胎，用0.5 mg·mL-1蛋白酶对胚胎进行脱卵膜处理适当时间，快速洗去蛋白酶，并用吸管反复轻柔地吹打胚胎，以帮助卵膜脱除。用移液枪移取卵液于24孔板中，每孔1 mL，每孔胚胎数为15～20条，设置阴性对照组(0.1%DMSO处理)、药物低剂量组(1 μmol·L-1)、药物中剂量组(5 μmol·L-1)和药物高剂量组(10 μmol·L-1)，每组设置3个复孔。加药结束后，将24孔板置于28.5 ℃恒温培养箱中培养一定时间，观察转基因斑马鱼翘尾情况，以评价目标化合物Aw的抑制血管新生活性。

2 结果与讨论

2.1 中间体与目标化合物的表征

化合物Ⅱ：m.p.118～119 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:9.93(1H,s,―CHO),7.17(2H,s,H-3,H-5),3.92(6H,s,2×―OCH3),2.38(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:191.1,168.1,152.8,134.3,115.0,106.0,56.3,20.4;ESI-MS,m/z:225.1 [M+H]+。

化合物Ⅲ：m.p.98～99 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.66(2H,s,H-3,H-5),4.69(2H,s,Ar-CH2―),3.84(6H,s,2×―OCH3),2.36(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.8,152.1,139.6,115.3,103.1,65.2,56.1,20.5;ESI-MS,m/z:227.1 [M+H]+。

化合物Ⅳ：m.p.75～76 ℃;1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:6.85(2H,s,H-3,H-5),4.73(2H,s,Ar-CH2―),3.76(6H,s,2×―OCH3),2.24(3H,s,―COCH3);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:168.3,152.0,139.4,115.0,103.2,60.7,56.1,20.4;ESI-MS,m/z:245.6 [M+H]+。

化合物Ⅴ：1HNMR(300 MHz,DMSO-d6),δ:7.92(3H,m,Ar-H),7.76(6H,dt,J=3.6 Hz、8.1 Hz,Ar-H),7.69(6H,m,Ar-H),6.30(2H,d,J=2.4 Hz,H-3,H-5),5.09(2H,J=15.0 Hz,Ar-CH2-),3.37(6H,s,2×-OCH3),2.21(3H,s,-OCH3);13CNMR(75 MHz,DMSO-d6),δ:168.4,152.0, 151.9,135.5,134.8,134.6,130.6,130.4,126.9,126.7,118.8,117.6,108.5,108.4,56.2,29.4,28.8,20.6;ESI-MS,m/z:507.9 [M+H]+。

目标化合物Aw：1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ:7.24(1H,m,H-3′),7.09(1H,m,H-4′),6.89(2H,m,H-5′,H-6′),6.40(2H,s,H-3,H-5),5.40(1H,brs,Ar-OH),3.86(9H,s,3×-OCH3),2.90～2.85(4H,m,-CH2CH2-);13CNMR(75 MHz,CDCl3),δ:161.1,160.6,149.7,148.3,137.1,133.4,129.8,123.6,120.9,114.0,105.5,56.7,55.9,40.9,36.7;ESI-MS,m/z:311.1 [M+Na]+。

2.2 目标化合物Aw的抑制血管新生活性

以72 hpf转基因斑马鱼为筛选模型，考察目标化合物Aw对斑马鱼血管新生的影响，结果如图2所示。

图2 目标化合物Aw对斑马鱼血管新生的影响Fig.2 Effect of target compound Aw on angiogenesis in zebrafish

从图2可以看到，与阴性对照组相比，实验组转基因斑马鱼均发生了翘尾，且随着目标化合物Aw剂量的增加，翘尾越来越严重；目标化合物Aw抑制转基因斑马鱼体节间血管的生成呈浓度依赖性。表明，目标化合物Aw具有抑制血管新生活性。

3 结论

以4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛为原料，以Wittig反应为关键步骤，通过7步反应合成了4-羟基-3,5,2′-三甲氧基联苄，通过1HNMR、13CNMR 、ESI-MS确证了其结构；在体转基因斑马鱼实验结果表明，4-羟基-3,5,2′-三甲氧基联苄具有抑制血管新生活性，可以使斑马鱼发生翘尾，同时抑制体节间血管的生成。推测4-羟基-3,5,2′-三甲氧基联苄可以通过抑制血管新生来发挥抗肿瘤作用。