李 坤，肖 盟

(青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042)

粘土作为水体沉积物中的重要组成部分，对藻细胞具有一定的聚集作用，可形成10～100 μm的藻细胞聚集体，然后快速沉降到水体底部沉积物中[10]，避免被微型浮游动物及其它掠食者捕食，且在水体底部缺氧条件下聚集体有机质可以有效保存[11]。聚集体的沉降速度随着聚集体粒径的增大而加快[12]，而碳酸盐在聚集体周围的矿化能够增加聚集体的质量，加快沉降速度，对聚集体有机质的保存也起到了一定的促进作用。

目前，研究者对碳酸盐的生物诱导过程研究较多，但对环境因素的考察还较少，如粘土矿物对碳酸盐生物诱导过程的影响尚未见报道。基于此，作者在蒙脱土作用下利用聚球藻诱导碳酸盐矿化，测定pH值、叶绿素a含量、碳酸酐酶活性，分析碳酸盐矿物的组成和形貌，探讨蒙脱土对碳酸盐生物诱导过程的影响。

1 实验

1.1 材料、培养基与仪器

蒙脱土(粒径约2.5 μm)，中国麦克林；聚球藻(Synechococcussp.)，中国科学院水生生物研究所。

BG11培养基(g·L-1)：NaNO31.5，K2HPO4·3H2O 0.040，柠檬酸铁铵 0.006，柠檬酸0.006，EDTA 0.001，H3BO32.86,MnCl2·4H2O 1.81,ZnSO4·7H2O 0.222,CuSO4·5H2O 0.079,NaMoO4·2H2O 0.39,Co(NO3)2·6H2O 0.049 4,Ca(CH3COO)2·H2O 7.91,Mg(CH3COO)2·4H2O 10.67[13];pH值7.0，105 ℃高压灭菌30 min。所用试剂均为市售分析纯。

752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；安捷伦5110型电感耦合等离子体发射光谱仪，美国安捷伦公司；D8 ADVANCE型X-射线衍射仪，德国Bruker；FEI NanoSEM 450型场发射扫描电镜，美国FEI公司。

1.2 聚球藻对碳酸盐的诱导矿化实验

分别向BG11培养基中加入不同量(0 mg·L-1、5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1)的蒙脱土，再按10%接种量接种扩培后的聚球藻(OD680=0.7)，在光照强度为2 000 Lux、转速为120 r·min-1、温度为25 ℃、光暗周期为12 h∶12 h的条件下培养12 d。每组实验设置3个平行。

1.2.1 聚球藻生理生化性能的测定

每隔48 h取样测定pH值、叶绿素a含量(表征藻细胞浓度[14])、碳酸酐酶活性，考察蒙脱土对聚球藻生理生化性能的影响。

采用pH计测定培养液pH值。

叶绿素a含量的测定：将各样品静置30 min，取上层培养液5 mL于3 000 r·min-1离心10 min，弃上清液；加入等体积丙酮于4 ℃下静置24 h，离心，取上清液，分别测定649 nm、665 nm处吸光度，按式(1)计算叶绿素a含量(mg·L-1)：

叶绿素a含量=12.47A665-3.62A649

(1)

碳酸酐酶活性的测定[15]：将0.013 9 g对硝基苯酚溶解于100 mL磷酸盐缓冲液中，配制1 mmol·L-1对硝基苯酚溶液，4 ℃下保存。分别取0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL对硝基苯酚溶液置于试管中，加蒸馏水至3 mL，测定各溶液在400 nm处的吸光度，绘制标准曲线。然后将0.018 1 g醋酸对硝基苯酚溶解于0.5 mL无水乙醇中制成工作液Ⅰ，将0.156 0 g二乙基丙二酸二乙酯溶解于99.5 mL磷酸盐缓冲液中制成工作液Ⅱ，将工作液Ⅰ与工作液Ⅱ混合制成工作液Ⅲ；将1.5 mL工作液Ⅲ和1.5 mL培养液混合，测定混合液在400 nm处吸光度(A0)；再将混合液置于35 ℃水浴中，30 min后测定混合液在400 nm处吸光度(A1)；根据标准曲线方程计算对硝基苯酚的初始浓度(c0，μmol·L-1)和最终浓度(c1，μmol·L-1)。按式(2)计算碳酸酐酶活性(U·L-1，每分钟每升培养液释放1 μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1 U)：

(2)

1.2.2 藻细胞聚集率的测定

于20 mL离心管中加入10 mL扩培后的聚球藻(OD680=0.7)，分别加入5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1的蒙脱土，以不加蒙脱土为对照，于摇床中120 r·min-1振荡培养2 h后取出，2 500 r·min-1离心1 min，取上清液，按1.2.1方法测定叶绿素a含量(ca)，按式(3)计算藻细胞聚集率(%)：

(3)

1.2.3 镁钙比的测定

1.2.4 碳酸盐矿物组成与形貌的分析

将加入50 mg·L-1蒙脱土的培养液于5 500 r·min-1离心10 min，将沉淀物冷冻干燥，采用X-射线衍射仪测定碳酸盐矿物组成；将沉淀物用体积分数10%的H2O2浸泡去除有机质，蒸馏水洗涤，70 ℃干燥10 h，采用扫描电镜观察碳酸盐矿物形貌。

2 结果与讨论

2.1 蒙脱土对聚球藻生理生化性能的影响

在培养基中加入不同量的蒙脱土，测定pH值、叶绿素a含量、碳酸酐酶活性，考察蒙脱土对聚球藻生理生化性能的影响，结果如图1所示。

图1 蒙脱土对聚球藻生理生化性能的影响Fig.1 Effect of montmorillonite on physiological and biochemical characteristics of Synechococcus sp.

由图1可以看出:(1)蒙脱土对培养液pH值的影响不大，加入蒙脱土和未加蒙脱土时，培养液pH值的变化规律一致，均随培养时间的延长逐渐增大，最后稳定在8.5左右。(2)蒙脱土对培养液叶绿素a含量的影响显著，未加蒙脱土时，叶绿素a含量在培养8 d时达到最高；而加入5 mg·L-1或50 mg·L-1蒙脱土后，叶绿素a含量在培养6 d即可达到最高，且叶绿素a含量最高值随蒙脱土加量的增加逐渐降低，在蒙脱土加量为500 mg·L-1时叶绿素a含量最低。表明蒙脱土加量的增加会引起聚球藻细胞的大量聚集，从而减少了水体中聚球藻的数量并限制了聚球藻的生长。(3)蒙脱土对培养液碳酸酐酶活性的影响不大，加入蒙脱土和未加蒙脱土时，培养液碳酸酐酶活性的变化规律整体一致，随培养时间的延长先升高后降低随后再升高再降低，在培养6 d时达到最高，且碳酸酐酶活性最高值随蒙脱土加量的增加整体呈降低趋势，在蒙脱土加量为500 mg·L-1时碳酸酐酶活性最低。综上表明，蒙脱土的加入，会导致聚球藻细胞的聚集，从而对碳酸酐酶活性有一定的抑制作用，且该抑制作用随着蒙脱土加量的增加整体逐渐增强。

2.2 蒙脱土对聚球藻细胞的聚集作用

按1.2.2方法测定蒙脱土加量分别为5 mg·L-1、50 mg·L-1、500 mg·L-1时的藻细胞聚集率，结果如图2所示。

图2 蒙脱土对藻细胞聚集率的影响Fig.2 Effect of montmorillonite on aggregation rate of Synechococcus sp.cells

由图2可以看出，蒙脱土对聚球藻具有一定的聚集作用，蒙脱土加量越多，聚集效果越好。这是因为，阳离子桥键和静电斥力的综合作用是聚球藻细胞在蒙脱土表面吸附的主要原因；由于粘土矿物颗粒表面常带负电荷，电荷零点为3.6[16]，而微生物表面含有羧基、磷酰基、氨基等功能基团，总体上也带负电荷[17]，因此，蒙脱土与聚球藻之间存在静电斥力；但聚球藻产生的部分胞外多糖由糖醛酸组成，糖醛酸是阴离子糖，可以与带负电荷的蒙脱土颗粒形成阳离子桥键，进而克服势能障碍[18]并最终聚集。

2.3 蒙脱土对镁钙比的影响

4组实验培养液中Ca2+、Mg2+浓度及镁钙比结果如图3所示。

图3 蒙脱土对镁钙比的影响Fig.3 Effect of montmorillonite on magnesium calcium ratio

由图3可以看出：(1)对照组Ca2+、Mg2+浓度分别为1 961.1 mg·L-1、1 156.1 mg·L-1，加入蒙脱土后，Ca2+、Mg2+浓度分别降至1 849.9 mg·L-1、1 095.6 mg·L-1，吸附率分别为5.67%和5.23%，说明，蒙脱土对Ca2+、Mg2+均具有一定的吸附作用，但吸附率相差不大。(2)当在体系中加入聚球藻后，Ca2+、Mg2+浓度均显著降低，其中Ca2+浓度降幅较大，聚球藻组Ca2+浓度从1 961.1 mg·L-1降至933.9 mg·L-1，降低52.38%，推断主要源于聚球藻对Ca2+的矿化；聚球藻+蒙脱土组Ca2+浓度降至923.3 mg·L-1，降低52.92%，表明蒙脱土对Ca2+的矿化无明显影响。对于Mg2+浓度，聚球藻组Mg2+浓度从1 156.1 mg·L-1降至1 033.7 mg·L-1，降低10.59%，主要源于聚球藻的矿化作用；聚球藻+蒙脱土组Mg2+浓度降至953.2 mg·L-1，降低17.55%。加入聚球藻后，Mg2+浓度虽然有所降低，但低于Ca2+的矿化量，原因是Mg2+水合脱水所需要的能量远高于Ca2+所需要的能量[19]。(3)对照组、蒙脱土组、聚球藻组、聚球藻+蒙脱土组的镁钙比依次为0.982 6、0.987 1、1.844 8、1.720 7，表明，蒙脱土的加入会略微升高培养液的镁钙比，而聚球藻的加入会显著升高培养液的镁钙比，且聚球藻组的镁钙比要高于聚球藻+蒙脱土组，充分说明，聚球藻的存在能够显著改变培养液中的镁钙比，进而创造一个相对较高的镁钙比环境。

2.4 碳酸盐矿物组成分析

当蒙脱土加量为50 mg·L-1时，聚球藻组、聚球藻+蒙脱土组培养液沉淀物的XRD图谱如图4所示。

图4 沉淀物的XRD图谱Fig.4 XRD patterns of sediments

由图4可以看出，聚球藻组、聚球藻+蒙脱土组的培养液沉淀物碳酸盐矿物组成相同，主要为文石和低镁方解石，其中低镁方解石的最强衍射峰出现在29.5°，对应(104)晶面，其峰高分别为202 950和13 517，表明蒙脱土的加入，使得低镁方解石的主衍射峰强度明显降低，矿物的结晶度明显降低；文石的衍射峰出现在27.2°、33.1°、36.1°、41.2°、42.9°、45.8°处，分别对应(102)、(201)、(210)、(121)、(212)、(122)晶面，且加入蒙脱土后，文石的衍射峰强度明显增强，表明蒙脱土作用下，矿物的结晶度升高。

2.5 碳酸盐矿物形貌分析

当蒙脱土加量为50 mg·L-1时，聚球藻组、聚球藻+蒙脱土组培养液沉淀物中碳酸盐矿物的SEM照片如图5所示。

a.聚球藻组 b.聚球藻+蒙脱土组

由图5a可以看出，未加蒙脱土时，聚球藻组碳酸盐矿物为棒状和四叶草状，粒径为15～60 μm，能谱显示为低镁方解石，其间可见藻细胞经H2O2氧化降解后残留的模孔，表明藻细胞呈聚集状态，碳酸盐矿物在细胞周围析出；随着碳酸盐矿物的生长，藻细胞被包埋在碳酸盐矿物内部，这可能是引起叶绿素a含量和碳酸酐酶活性降低的原因。由图5b可以看出，加入蒙脱土后，聚球藻+蒙脱土组除了棒状低镁方解石外，还存在簇状碳酸盐矿物，能谱显示该簇状碳酸盐矿物不含镁元素，结合形貌判定为文石，粒径为5～15 μm。表明，未加蒙脱土时，聚球藻诱导的碳酸盐矿物主要为棒状低镁方解石；加入蒙脱土后，碳酸盐矿物除棒状低镁方解石外，还存在大量簇状文石，该结果与XRD分析结果相符。

镁元素的含量能够影响碳酸盐矿物的形貌和类型，因此，镁钙比被认为是碳酸盐矿物形成的关键动力学因素[20]。研究发现，方解石通常形成于较低镁钙比的环境中，而文石通常形成于较高镁钙比的环境中[21]，其原因是较高浓度的Mg2+在方解石表面的吸附能够破坏方解石的晶体结构，但对文石的形成没有影响[22]。有研究表明，镁钙比为2时能够产生方解石和文石，镁钙比为4～6时仅产生文石[6]。本实验中，未加蒙脱土时的文石量较少，表明未达到形成文石所要求的镁钙比；而加入蒙脱土后，由于蒙脱土对聚球藻的聚集作用，使得藻细胞聚集体中羧基数量增加、密度升高，而羧基对Ca2+具有较高的亲和力，能够吸附更多的Ca2+，从而使得藻细胞聚集体微环境水体中镁钙比升高。所以推测蒙脱土的加入使藻细胞聚集体周围微环境的镁钙比较高，有利于文石的产生。

3 结论

在蒙脱土作用下利用聚球藻诱导碳酸盐矿化，发现聚球藻能够诱导碳酸盐矿化产生低镁方解石和文石，且以棒状低镁方解石为主，粒径为15～60 μm，其间可见藻细胞氧化降解后残留的模孔。蒙脱土能够促进聚球藻细胞聚集，增加了藻细胞聚集体中的羧基数量，使得藻细胞聚集体周围微环境的镁钙比升高，抑制了方解石晶核的生长，产生大量簇状文石，粒径为5～15 μm。