王 芳，陈 敏，杨冬燕，毛 伟

重庆市血液中心，重庆 400000

ABO血型正确定型和RhD正确定型是《血站技术操作规程》中规定采供血机构强制性检测的项目，准确、快速的血型检测也是为临床提供血液的安全性要求之一，是保障安全输血的重要前提[1]。全自动血型检测系统具有快速、准确，易于标准化、信息化和自动化的优点，满足采供血机构大规模标本的血型筛查[2-3]。由于全自动血型检测系统受方法学的限制，时有ABO血型亚型漏检的情况。本文就筛查实验室用PK7300全自动血型检测仪漏检的血型进行原因分析和鉴定，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 献血者，男，18岁，汉族，血型复查时发现ABO血型正反定型不一致，将标本送至中心输血研究所进行血型的确认。

1.2试剂和仪器 单克隆抗A、抗B血型定型试剂(试剂1)、单克隆抗H定型试剂(上海血液生物)；单克隆抗A、抗B血型定型试剂(试剂2，长春博德)；人源抗A、抗B试剂(试剂3)、抗AB试剂(中国医学科学院输血研究所)；人ABO血型反定型用红细胞试剂、A2细胞试剂(上海血液生物)，试剂均在有效期内。Gene Quant Pro型DNA 浓度测定仪(英国)、ABI PE9700型扩增仪(美国)、 Power Pac 3000型电泳仪(美国)、KST-5500型凝胶成像分析系统(北京东迅)、血型血清学离心机 KA-2200 SeromamticⅡ(日本KUBOTA)、全自动血型分析仪PK7300(贝克曼)(以下简称PK7300)。

1.3方法

1.3.1血清学检测 ABO正反定型(纸板法、试管法)和吸收放散试验按照相关试剂说明书及《全国临床检验操作规程(第4版)》进行操作。

1.3.2基因检测 (1)DNA提取。以Puregene Blood Core Kit B DNA提取试剂(德国Qiagen)抽提全血标本中基因组DNA。浓度大于20 ng/mL，A260/A280比值在1.6～1.9的标本可用于检测，按照试剂盒说明书进行操作。(2)ABO血型基因SSP检测。按照人类红细胞ABO血型Cis-AB，B(A)基因分型试剂盒和A亚型基因分型试剂盒(PCR-SSP，天津秀鹏)试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0对数据进行整理。

2 结 果

2.13种不同厂家标准血清试剂采用试管法检测献血者血型结果分析 通过血型血清学反应格局分析，献血者的血型疑为A亚B型或B(A)，需用分子生物学方法进行确定。见表1。

表1 3种不同厂家试剂检测ABO血型检测结果

2.2纸板法和PK7300检测结果分析 实验室常规使用的检测试剂(试剂2)进行血型的检测，检测结果显示ABO血型为B型。

2.3ABO基因型检测结果 人类红细胞ABO血型-A亚型基因分型结果为B/O2，说明该献血者没有A基因，可以排除A亚B的可能。琼脂糖凝胶电泳见图1。人类红细胞ABO血型-cis-AB，B(A)基因分型结果为B(A)04/O2，结合血清学检测结果和A亚型分型试剂盒结果判断该献血者的血型结果为B(A)型，琼脂糖凝胶电泳胶图见图2。

注：1～9为引物A201～A211；10～15为引物A301～A307；16～26为引物AW01～AW14；27～28为引物AM01～AM02；29～37为引物AX01～AX16；38～41为引物AeL02、04-06；42为引物A/O；43为引物B；44为引物O1；45为引物O2；46为阴性对照。图1 ABO血型-A亚型基因分型电泳图谱

注：1为引物cisAB01；2为引物cisAB01，B(A)01；3为引物B(A)01，B(A)03；4为引物cisAB02；5为引物B(A)02；6为引物cisAB03；7为引物B(A)04；8为引物B(A)06；9为引物cisAB04；10为引物B1；11为引物B2；12为引物O1；13为引物O2；14为阴性对照。图2 ABO血型-cis-AB，B(A)基因分型电泳图谱

3 讨 论

PK7300检测血型的原理是利用红细胞的自然沉降通过机器视觉检测系统(CCD系统)进行图像数字化处理，利用独特参数判断是否发生凝集来进行血型的检测。由于血型检测数据保存在图像处理器的内存中便于随时调用和分析，同时原始结果均以数据形式保存，保证了结果的可靠性、完整性和可追溯性，在安全供血和举证方面有积极的意义，已被血型检测标本量大的采供血机构血液筛查实验室广泛使用[4]。

目前ABO血型的初筛和鉴定过程复杂，各个环节都可能造成漏检，如试剂的批间差异、全自动血型仪初筛的局限性，检测人员的个体差异以及亚型复杂的表型特征也是造成漏检的原因[5]，采供血机构检验科为保证血型检测的准确和及时，制订了严格的检测和疑难血型的送检流程，便于发现因正反定型不相符、弱凝集、全凝集等导致血型检测异常情况，尽可能避免罕见亚型漏检。

B(A)血型是具有与cisAB相似的顺式遗传方式的罕见ABO亚型，目前共有7种B(A)等位基因，国内报道B(A)02、B(A)04、B(A)05和B(A)06共4种，B(A)04的基因频率最高为1.6/100 000，其次是B(A)02频率为0.78/100 000[6]，本研究的血型是中国人群中常见的B(A)04，在经典的血清学检测中是不能区别具体是哪种亚型，需要通过分子生物学检测才能确认具体的亚型型别。B(A)血型分子机制是由于单碱基突变，在B基因基础上发生错义突变，形成具有编码A抗原和B抗原双功能活性酶的能力，红细胞上同时表达弱的A抗原和强的B抗原，血清学特点是红细胞能与抗-B发生强凝集，与抗-A发生弱凝集或不凝集，血清中含有抗-A，能凝集或部分凝集A2红细胞，表现为A弱B，因独特血清学特点，易在血清学检测中发生漏检[6-8]。研究报道cisAB和B(A)与A或B基因杂合的献血者漏检频率约为82.8%，cisAB和B(A)与O基因杂合是漏检频率约为11.8%[9]，单纯依靠血清学方法无法准确鉴定cisAB和B(A)亚型，需要进行分子生物学鉴定，才能得到正确的血型结果。

通过对本例B(A)血型的鉴定和原因分析，发现检验科使用全自动血型检测系统PK7300进行血型检测时，通过血型分析仪参数的设定和制订的检测策略能检出部分有问题的血型，而部分罕见亚型因方法学的局限性、试剂间的差异和亚型血清学特点的多态性，不能被有效检出，漏检的情况时有发生。因此有必要在筛查实验室对血型检测试剂的质量进行充分有效地评估和献血者ABO亚型血地筛查，在现有基础上制订更加有效的筛查策略。