吴汉锋，赵 辉，黄家亮，甘桂春，李炎炎

广西壮族自治区贵港市妇幼保健院遗传实验室，广西贵港 537100

出生缺陷是人口出生素质下降的主要因素，是导致早期流产、死胎、婴幼儿死亡和先天残疾的主要原因，其中染色体结构及数目变化所致的遗传疾病约占出生缺陷的80%以上[1]。产前诊断即在胎儿出生前利用医学检验、细胞遗传学、分子及基因检测、医学影像学等检测手段了解胎儿在宫内的状态，在胎儿出生前确诊先天性疾病和遗传性疾病，从而进一步进行宫内治疗或产前干预。产前诊断是预防遗传疾病的重要环节，是避免遗传病患儿出生的有效手段。虽然染色体核型分析技术多年来被视为产前诊断的“金标准”，但由于技术方法的局限性，只能辨别染色体5～10 Mb以上的片段异常，染色体微小结构的变异和其他基因变异不能被检出，所以染色体核型分析需和其他遗传检测技术相结合进行检测，提高染色体小片段异常检出率。LIANG等[2]介绍了基于二代测序技术的基因组拷贝数变异测序(CNV-Seq)方法，CNV-seq具有检测范围广、操作简便、报告周期短、兼容性好等优点。《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》指出，孕妇可以选择CNV-seq检测作为一线的产前诊断方法，前提是孕妇充分知情了解[3]。本研究探讨CNV-seq和染色体核型分析技术在产前诊断中的应用价值，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年2月至2021年12月在本院优生遗传科就诊的1 155例孕中期孕妇为研究对象，1 155例孕妇均具有产前诊断指征。产前诊断指征包括高龄妊娠(n=256)、孕中期血清学唐氏筛查高风险(n=97)、无创产前筛查高风险(n=89)、不良孕产史(n=90)、B超影像学软指标异常(n=485)等。孕妇年龄17～48岁，孕周20～28周，排除双胎及多胎妊娠者。根据不同孕周选择羊膜腔穿刺术或脐静脉穿刺术，抽取羊水和脐带血在2 h内送至本院遗传实验室进行接种培养，报告1个月内发出；CNV-seq检测当天将标本按要求寄往深圳华大医学检验实验室检测，报告15 d内发出。所有孕妇及家属在侵入性产前诊断前均接受临床医生详细的遗传咨询，充分提示孕妇及家属穿刺术所带来的风险及检测方法的局限性，孕妇及家属知情了解后签署染色体核型分析和CNV-seq知情同意书。

1.2方法

1.2.1染色体核型分析 优生遗传科医生在超声监测下穿刺抽取羊水20 mL，脐带血穿刺抽取1.5 mL，所有操作均按无菌要求进行。羊水及脐带血染色体核型分析实验操作过程均为双人双线平行操作，按标准操作要求进行室内质控和参加全国室间质评。蔡司全自动染色体扫描仪扫描染色体图片，利用染色体分析软件进行分析和计数，两线分别计数至少10个分裂象，分析至少5个完整清晰染色体核型并保存归档，命名规则按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)标准进行，如有异常核型则加量计数和分析。

1.2.2CNV-seq检测 孕妇签署知情同意书后，在超声下引导无菌穿刺抽取羊水10 mL，穿刺抽取脐带血1.5 mL，抽取孕妇外周血5 mL，标本按要求寄送至深圳华大医学检验实验室检测。所有标本常规进行联合短串联重复序列(STR)连锁分析及母源污染鉴定。深圳华大医学检验实验室采用高通量测序技术，对受检标本提取 DNA进行全基因组测序和生物信息学分析，结合STR和甲基化特异性PCR，测序所得的unique reads 与GRCh37/UCSC release hg19参考基因组进行比对，检出100 kb以上的微重复微缺失变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)发布的指南进行染色体拷贝数变异(CNV)致病性解读，对检测到的CNV的致病性进行评估，将结果分为5类，分别是已知致病变异、疑似致病变异、临床意义不明变异、良性变异及疑似良性变异，良性变异和疑似良性变异不在报告中体现。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件对数据进行整理。

2 结 果

1 155例羊水和脐带血均培养成功，均出具染色体核型分析报告。检出染色体异常97例，异常检出率为8.39%，其中数目异常63例，包括21-三体37例、18-三体8例、13-三体1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；结构异常25例，染色体嵌合体9例。CNV-seq无检测失败现象，出具1 155份报告，检出染色体非整倍体及100 kb以上的CNV 112例，异常检出率为9.69%，其中非整倍体63例，包括21-三体37例、18-三体8例、13-三体1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；已知致病性变异30例，疑似致病变异16例，嵌合体3例。1 155例孕妇标本染色体核型分析与CNV-seq共同检出异常83例，其中染色体数目异常63例，CNV-seq检测出非整倍体63例，非整倍体符合率为100%，其他异常20例，见表1；染色体核型异常而CNV-seq未检出的共14例，包括染色体平衡易位、染色体倒位、染色体嵌合体，见表2。染色体核型未检出而CNV-seq检出异常的共29例，见表3。

表1 20例染色体核型分析与CNV-seq检测均异常结果

续表1 20例染色体核型分析与CNV-seq检测均异常结果

表2 14例染色体核型分析异常而CNV-seq结果正常

表3 29例染色体核型分析正常而CNV-seq结果异常

3 讨 论

本研究中，CNV-seq异常检出率为9.69%，染色体核型分析异常检出率为8.39%，CNV-seq检测的异常检出率比染色体核型分析高1.30%，与其他研究异常检出率报道结果相似[4]。CNV-seq与染色体核型分析共同检出异常核型83例，其中非整倍体63例检测结果一致，非整倍体检测符合率100%。其余20例染色体核型为结构缺失、重复、衍生等，由于染色体核型分析技术的局限性，只能分辨大于5 Mb的片段异常，且对异常片段的来源及定位受培养制片和显带技术的影响无法准确辨别。表1中的20号病例，染色体核型分析看到的是一个标记染色体，标记染色体片段较小，通常小于同一分裂象中的20号染色体，没有可供识别的染色体带纹以提示其来源，但CNV-seq检测结果提示该标记染色体来源于15q11-13，即15q11-13重复综合征。该综合征临床特征包括自闭症、智力低下、共济失调、癫痫发作、发育迟缓和行为问题[5]。胎儿父母进行了CNV-seq检测，检测结果显示母亲为15q11-13重复综合征，母亲的临床症状为肌张力低、发育迟缓、抽搐、孤独谱系障碍，特殊面容，最终该孕妇选择了终止妊娠。表1中的3、5、8、10、14号病例染色体核型描述为衍生染色体，CNV-seq检测均对其片段来源及染色体微缺失微重复片段大小进行了快速精准的辨别，为产前诊断临床咨询提供可靠的依据。

CNV-seq不适宜用于检测染色体平衡易位、染色体倒位、染色体整倍体及杂合性缺失(UPD)等，有待于CNV-seq技术的深入研究。表2中的24、25、27、33、34号病例染色体核型描述为平衡易位或罗伯逊易位，21号病例为4号染色体倒位，CNV-seq检测这些病例结果均为未见异常。由于染色体平衡易位和倒位不涉及染色体片段的丢失和重复，且染色体断裂重接后没有影响相关基因的功能，该类患者一般无染色体疾病的表型，只是在生育时会形成异常的配子，导致流产、死产及产生染色体异常后代[6]。本研究中表2的染色体倒位及平衡易位的孕妇均选择继续妊娠，随访至胎儿出生后表型均未见异常。表2中的29号病例，染色体核型描述为标记染色体，CNV-seq检测未见异常，表明该标记物只是异染色质，无染色体遗传物质，亲本验证为遗传母亲核型，母亲表型无异常，该孕妇选择继续妊娠。由于染色体微小结构变化所导致的遗传性疾病称为染色体微缺失/微重复综合征，传统的染色体核型分析技术不能够分辨，缺失或者重复的片段小于5 Mb，是基因组CNV主要表现形式。至今为止，由致病性基因CNV所致的染色体微小结构变化综合征已达300多种[7-8]，10%～20%的智力障碍患者通过CNV-seq检测可以找到病因[9-11]，可以确诊5%～15%的孤独症谱系患儿[12]。本研究表3中的29例患者CNV-seq检测结果均为小于5 Mb的缺失或重复，其中15例为已知致病变异，14例为疑似致病变异，而染色体核型分析结果均未见明显异常。41、49、56、59、60、61、62号病例，CNV-seq检出15q11.211.2区域缺失，该区域与15q11.2缺失综合征有关，可能会增加神经精神性疾病或神经发育障碍的易感性，包括精神运动发育迟缓、语言发育迟缓、自闭症、多动症、强迫症及癫痫[13]。46、47、50、53、57号病例，CNV-seq检测结果为22q11.2q11.2区域大小不同片段缺失，该区域包含ClinGen判断的剂量敏感区域，即22q11.2缺失综合征。临床表现为颅面部畸形、先天性心脏病、免疫缺陷和低钙血症三大症状，新生儿中该病的发病率为1/6 000[14]。CNV-seq检测技术提高了染色体微缺失/微重复综合征的检出率[2.50%(29/1 155)]，同时也给临床医生咨询带来了挑战和困难，临床医生需要结合临床及溯源胎儿父母的CNV-seq检测结果综合分析。

嵌合体是指两种或两种以上的细胞系存在于一个个体中，产前诊断嵌合体分为限制性胎盘嵌合体和真性胎盘嵌合体[15]。本研究表1中的17、19号病例染色体核型分析与CNV-seq均检出嵌合体，但是嵌合比例不一致，因为异常染色体在体外培养和细胞分裂的过程稳定性较差，造成嵌合比例存在差异，染色体结构也容易发生变异或丢失，所以CNV-seq检测尽量采用未经培养的羊水和脐带血[16]。表3中的39号病例，CNV-seq检测结果为14号染色体存在三体嵌合，异常比例约为39%，而染色体核型未检测出嵌合体，这种情况下需结合临床和超声，以及未培养羊水细胞间期Fish检测，如果Fish检测结果是阴性，则为假性嵌合体，后期继续B超监测妊娠情况。表2中的26、31、32号病例染色体核型出现平衡易位嵌合体，而CNV-seq检测结果为未见异常，平衡易位嵌合体大多数认为是部分细胞畸变在体外培养时发生，一般无明显的异常表型。表2中的病例30，染色体核型分析结果为47,XXX[6]/47,XX,+mar[8]/46,XX[99]，CNV-seq检测未见异常，可能原因是CNV-seq对嵌合体检测的灵敏度不高，嵌合比例不精准，对于47,XXX与45,X两种细胞嵌合，若两种细胞嵌合比例各占50%，CNV-seq检测结果会显示X染色体拷贝数未见异常[17]。CNV-seq检测对于嵌合体的理想检测比例为<5%，对低比例的嵌合体检测结果更精准[18]。对于真性嵌合体的鉴别，无论是染色体核型分析还是CNV-seq检测，建议至少两种技术检出嵌合体时才能确立真性嵌合体，只有一种技术检出嵌合体时，临床咨询解释需谨慎，需结合临床及胎儿影像学综合分析。

本研究中，产前诊断指征B超软指标异常485例，所占比例最高[41.99%(485/1 155)]，其中CNV-seq异常例数43例，占CNV-seq检测异常例数的38.39%(43/112)，CNV-seq检测或CMA是产前B超软指标异常首选的侵入性产前诊断方法[19]。

综上所述，CNV-seq检测与染色体核型分析技术各有优缺点，在产前诊断领域中CNV-seq检测具有良好的应用价值，对小片段的染色体结构异常能够精准定位及确定片段大小来源，可以作为进行产前诊断的一线方法，但是不能检出平衡易位及倒位等结构异常，对整倍体异常的检出也有局限性。两种方法联合应用于产前诊断领域，可以提高遗传病的检出率，避免遗传病患儿的出生，改善母婴健康状况，提高出生人口素质。