宋佳凝，冯国维

陕西省西安市儿童医院口腔科，陕西西安 710003

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是口腔癌常见病理分型，起源于口腔黏膜基底细胞层。流行病学调查显示，国内OSCC的发病有年轻化趋势，国内每年约有4.56万OSCC新发病例，5年生存率仅30.0%[1]。既往多关注成人OSCC，而有关OSCC在儿童中的报道较少。肿瘤细胞侵袭迁移是OSCC不良预后的高危因素[2]。既往研究证实，微小RNA(miRNA)作为内源性非编码蛋白质的小分子RNA，参与癌基因的激活或沉默表达，进而调控肿瘤细胞侵袭迁移[3]。报道显示，miR-382-5p在乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中异常表达[4-5]，推测miR-382-5p可能参与OSCC肿瘤细胞侵袭。抑癌基因张力蛋白同源基因(PTEN)具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重磷酸酶活性，CHEN等[6]提出miR-382-5p与PTEN存在靶向作用关系，推测这可能是miR-382-5p调控OSCC肿瘤细胞侵袭转移的机制之一。为验证上述结果，本研究收集本院12例OSCC患儿临床资料，并开展基础试验研究。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2021年3月本院收治的12例OSCC患儿作为研究对象，取癌组织和癌旁组织作为检测标本。纳入标准：(1)患儿均经病理活检确诊为OSCC[7]；(2)临床病例资料完整。排除标准：(1)合并有其他恶性肿瘤者；(2)既往接受放化疗或其他抗肿瘤治疗者；(3)合并有严重心肺基础疾病或肝肾功能不全者。12例患儿中男7例，女5例；年龄(9.42±3.36)岁；体质量指数(16.73±2.26)kg/m2；肿瘤部位：舌4例，口底3例，软腭2例，硬腭2例，唇1例；肿瘤分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期3例，Ⅲ期2例；分化程度：低分化6例，中分化5例，高分化1例。

1.2试剂 OSCC细胞CAL-27由中国医学科学院肿瘤研究所提供，DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)及胰酶-EDTA购自Gibco公司，D-hanks液购自南京森贝伽生物科技有限公司。转染试剂盒购自上海宾智生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1细胞培养和转染 采用含10% FBS的DMEM在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中对CAL-27细胞进行培养，取对数生长期细胞，弃培养基后采用D-hanks液洗涤细胞3次，用0.25%胰酶-EDTA消化液消化细胞，在培养皿中进行传代培养。以对数生长期细胞为转染对象，种植于培养板中，培养24 h后，在细胞融合度≥50%时进行转染，以Lipofectamine RNAi Max转染miR-NC和miR-382-5p抑制物至CAL-27细胞，转染方法参照转染试剂盒进行。根据转染内容不同分为si-NC组(以Lipofectamine RNAi Max转染miR-NC)和miR-382-5p抑制物组(以Lipofectamine RNAi Max转染miR-382-5p抑制物)。

1.3.2细胞迁移和侵袭试验 细胞迁移试验：取对数生长期细胞，采用无血清培养基对细胞进行培养，12 h后用胰酶-EDTA消化细胞，制备成106个/毫升浓度的细胞基液；分别在Transwell上室和下室加入100 μL细胞悬液和500 μL含10% FBS的DMEM，在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养10 h；取出小室，擦净后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗；采用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色；随机取4～6个视野，计算视野内穿过滤膜细胞数；以平均细胞数为迁移细胞数。细胞侵袭试验：取0.5 g/L Matrigel 人工基质胶20 μL，置于Transwell上室，在37 ℃条件下孵育4.0 h，Matreigel凝固后去残留液体，参照迁移试验方法制备细胞悬液，进行细胞染色，根据干预方法不同将试验细胞分为miR-382-5p抑制物+si-NC组(转染miR-382-5p抑制物阴性序列对照)和miR-382-5p抑制物+si-PTEN组(转染miR-382-5p抑制物+PTEN小干扰RNA)，记录两组细胞侵袭迁移数。

1.3.3qPCR检测 癌组织和癌旁组织解冻后送检，采用Trizol法提取总RNA，以RNA反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，完成后进行qPCR反应，引物设计见表1，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，以2-ΔΔCt计算miR-382-5p和PTEN相对表达量。

表1 qPCR引物序列

1.3.4双荧光素酶试验 采用Targetscan(http：//www.targetscan.org)对miR-382-5p进行靶基因预测，PTEN mRNA的野生型3′-UTR和突变型3′-UTR连接psi-CHECK-2载体，分别为PTEN-WT和PTEN-MUT(CAL-27细胞共转染miR-NC或miR-382-5p抑制物200 nmol/L)，根据共转染对象不同分别记为PTEN-WT+miR-NC组、PTEN-WT+miR-382-5p组、PTEN-MUT-miR-NC组及PTEN-MUT-miR-382-5p组。培养48 h后收集细胞裂解，采用Dual-Luciferase®Report Assay System 双荧光报告酶检测系统进行检测。

2 结 果

2.1两组细胞侵袭迁移试验结果 miR-382-5p抑制物组和si-NC组迁移细胞数分别为(178.25±30.29)个和(142.46±26.83)个，两组侵袭细胞数分别为(253.32±62.08)个和(202.41±54.54)个，两组间比较，差异均有统计学意义(t=3.064，2.134；P=0.006，0.044)。

2.2miR-382-5p靶基因 通过软件预测显示，PTEN可能是miR-382-5p潜在靶基因，见图1。miR-382-5p和PTEN在癌组织中的相对表达水平分别为0.87±0.31和0.72±0.26，癌旁组织相对表达水平分别为0.62±0.19和0.51±0.20。癌组织和癌旁组织miR-382-5p和PTEN相对表达水平比较，差异均有统计学意义(t=2.382，2.218；P=0.026，0.037)。双荧光素酶试验检测结果显示，PTEN-WT+miR-NC组和PTEN-WT+miR-382-5p组荧光活性变化倍数分别为0.87±0.12和0.33±0.09，两组间比较，差异有统计学意义(t=12.471，P<0.05)，PTEN-MUT-miR-NC组和PTEN-MUT-miR-382-5p组荧光活性变化倍数分别为0.79±0.22和0.77±0.18，两组间比较，差异无统计学意义(t=0.244，P=0.810)。

注：Targetscan数据库预测显示，PTEN 3′UTR存在miR-382-5p结合位点。图1 Targetscan数据库预测结果

2.3抑制PTEN表达逆转miR-382-5p对CAL-27细胞迁移侵袭的影响 miR-382-5p抑制物+si-NC组和miR-382-5p抑制物+si-PTEN组细胞迁移数分别为(170.45±35.56)个和(274.10±81.36)个,细胞侵袭数分别为(138.96±32.25)个和(180.04±25.63)个，两组间比较，差异均有统计学意义(t=4.044，3.455；P=0.001，0.002)。

3 讨 论

肿瘤细胞侵袭迁移是OSCC生长转移的重要病理基础，而肿瘤细胞与肿瘤局部微环境的相互作用与OSCC发生发展密切相关，二者共同作为靶点[8]，这将是优化OSCC治疗方案的重要方向。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境主要的间质细胞，来源于骨髓间充质干细胞，基础研究证实CAFs可通过分泌趋化因子、生长因子及细胞外基质，进而加快肿瘤血管内皮细胞增殖，促进肿瘤血管生成[9]。曹娟等[10]还发现CAFs可通过外泌体调控OSCC细胞生物学行为。因而，本研究选取CAF-27作为OSCC细胞进行试验。

miRNA作为非编码单链RNA分子，通过与靶mRNA 3′-UTR区特异性位点结合，降解mRNA，从而调控靶基因，发挥生物学功能，参与肿瘤癌变[11]。miR-382-5p已被证实在多种恶性肿瘤中存在异常表达，赵树鹏等[12]发现miR-382-5p可通过介导PTEN表达，抑制胶质瘤细胞增殖侵袭，而刘冬冬等[13]则发现miR-382-5p可通过抑制PTEN阻断白血病NB4细胞分化。PTEN编码蛋白由N端磷酸酶催化域和C端结构域2个结构域构成，定位于10q23.3染色体，是机体重要抑癌基因，PTEN活性作用可通过磷酸化、泛素化、乙酰化等多种途径参与下游基因的调节，发挥生物学效应[14]。PORS等[15]也认为PTEN可经细胞核参与细胞染色体DNA的修复，并通过PIK/AKT信号通路，调控肿瘤细胞迁移侵袭。另外，PTEN通过小泛素样修饰蛋白分子翻译后途径参与肿瘤生物学行为[16]。但PTEN是否参与CAF-27细胞分裂增殖，临床尚未形成定论。

本研究行细胞侵袭迁移试验，结果显示，miR-382-5p可促进OSCC细胞侵袭，而双荧光素酶试验检测进一步说明PTEN为miR-382-5p的靶基因，提示miR-382-5p可与PTEN的3′-UTR区位点结合，进而调控OSCC生长。另外，本研究行细胞转染和Transwell试验检测，结果显示，miR-382-5p抑制物+si-PTEN组细胞侵袭迁移数显著增加，这提示抑制PTEN表达可逆转miR-382-5p抑制物对CAL-27细胞侵袭迁移的抑制作用。此外，本研究收集OSCC患儿癌组织和癌旁组织，采用qPCR法进一步证实miR-382-5p和PTEN在癌组织和癌旁组织中的相对表达水平不同，结果也说明miR-382-5p可能通过调控PTEN参与OSCC病理进程。

综上所述，miR-382-5p在OSCC患儿中呈高表达，可能通过调控PTEN参与CAL-27细胞的侵袭迁移。