郭维盛，郭和利，郭湧，郭秀权，苏新国

（1.广东笑咪咪食品有限公司，广东 潮州 515638；2.广东农工商职业技术学院，广东 广州 510507）

随着现代人生活节奏加快，慢性咽炎、无病因咳嗽以及口腔溃疡等问题成为常态，润喉糖具有清热解毒、清肺止咳、清新口气、提神解困等作用，消费需求不断升级，2019 年我国润喉糖市场产量已经达到4.28 万吨，规模增长至31.62 亿元。目前国产润喉糖的主导产品是含中药成分的润喉产品，其作用温和，以缓解咳嗽、咽喉疼痛为主。润喉糖产品的配料包括甜味剂、转化糖、玉米糖浆和药食两用中药提取物，按照一定重量份比,经过混合、加热熬煮、冷却、风干、定型、包装工艺制作而成的固态或半固态甜味食品。常见的药食两用资源有甘草、胖大海、薄荷脑、生姜、茯苓、枸杞等，均富含多酚类抗氧化物质，具有润嗓、消肿、降火、解毒等功效[1]。如何提高多酚类物质的提取率，保持较高的抗氧化活性，对于提升润喉糖产品质量具有重要的意义。

近年来随着广东乡村振兴战略的实施，广东省共设立了16 个茶叶相关的现代产业园，在茶叶加工及深加工规模与日递增的同时，茶产品加工过程中产生了大量废弃物，如茶渣、茶梗、茶碎末等[2]。其中，茶梗在单丛茶生产中最为常见，约占总量的18%左右，茶梗富含多酚类物质，具有较好的抗氧化活性成分，植物多酚具有清除自由基、抗氧化、延缓衰老、预防心血管疾病、防癌、抗辐射等活性[3-4]，由于茶梗中纤维素含量较高，酚类物质的提取率较低，长期以来茶梗活性成分的研究较少。前期研究表明，润喉糖混合植物配料可以由甘草、胖大海、干生姜和单丛茶梗按照4：3：1：2 的比例复配，粉碎后添加纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶在50℃下发酵2h，可以破坏茶梗细胞壁和纤维素糖苷键，从而有利于后续的多酚类物质提取过程。

提取过程及其工艺参数对植物原料中生物活性成分的提取效率具有密切关系[5-6]。超声波辅助提取法利用超声波的机械作用、空化作用、热效应等，有效地促进多酚等成分溶出，提高目标成分的浸出率，具有绿色高效的特点[7]。响应面法可以通过多因素来优化复杂的提取过程，是优化提取植物中活性成分的一种有效方法[8]，本研究以润喉糖混合植物配料为原料，采用超声波辅助提取其多酚类物质，以多酚得率为指标，再通过响应面法对提取时间、提取温度、乙醇浓度和液料比四个因素，及其交互作用进行优化，研究超声波辅助提取的最佳工艺参数，后续将为充分开发和利用广东茶产业的茶梗资源，提高茶叶的附加值提供实验数据支撑。

一、材料与方法

（一）实验材料

单丛茶梗：2021 年6 月产自广东省潮州市登塘镇世田村丛山茶厂，经过3 次色选后剔除的单丛茶废弃物。甘草、胖大海、干生姜：2021 年10 月购置于广州市药材公司中药饮片厂，生产时间为2021 年7月。

（二）实验试剂

没食子酸标准品、分析纯无水乙醇、福林酚、碳酸钠、30%过氧化氢、抗坏血酸（VC）等均为分析纯，购自广州宴辰生物技术有限公司；纤维素酶（≥15 000 U/g）购自山东信得利生物工程有限公司，半纤维素酶（≥40 000 U/g）购自河北润步生物科技有限公司，淀粉酶（4U/mg）购自上海闳潞生物科技有限公司。

（三）实验仪器

BSA123-CW 电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；820DP 高功率数控超声波清洗器（深圳市光点超声波设备有限公司）；UV-27000岛津紫外可见分光光度计（岛津国际贸易有限公司）；SHA-C 水浴恒温振荡器（常州市亿能实验仪器厂）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。

（四）实验方法

1.混合植物配料制备

将甘草、胖大海、干生姜和单丛茶梗按4：3：1：2的比例复配，粉碎后过20 目筛，称取200g 混合植物配料粉，添加800mL 纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶（20：5：1）的复配酶溶液，将pH 值调整至6.5，在50℃下发酵2h，混合发酵液备用。

2.多酚回归方程的建立

参照胡栋宝等人[9]的方法进行完善，移取1.000 mg/mL 没食子酸标准品-乙醇溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL 和5.00mL 至50mL 容量瓶中，再加入10.0%福林酚溶液5.00mL。静置8min后，加入7.5%碳酸钠溶液4.00mL，混匀后分别用蒸馏水定容至50mL，在25℃室温下振荡反应90min后，在765nm 处测定体系吸光度A，并以吸光度A对没食子酸浓度c（mg/mL）进行线性回归，得多酚标准品回归方程：A=118.8c+0.031，R2=0.9916。

3.混合植物配料的多酚提取试验

称取10g 混合发酵液（干物质含量按20%计），置于1000 mL 锥形瓶中，以其干物质含量设定在已设定的因素水平表，采用不同的超声提取时间、超声提取温度、乙醇浓度和液料比进行提取，反复两次。合并提取液，浓缩至50mL，转移至100mL 容量瓶中，50%乙醇溶液定容，800 r/min 离心10 min 后收集上清液，按照标准曲线建立方法测定多酚含量。

4.多酚提取单因素试验

准确称取10g 混合发酵液原料，固定基准提取条件：超声提取时间30min，提取温度60℃，乙醇浓度50%，液料比30：1。单因素试验开展过程中，在所得单因素最佳水平基础上依次考察提取时间（10min～50min）、提取温度（40℃～80℃）、乙醇浓度（30%～70%）和液料比（10mL/g～50mL/g）对植物基料多酚提取效果的影响。

5.响应面优化试验方案设计

分析单因素试验结果，选定其中的显著因素为自变量，多酚提取量为响应值，利用Box-Bohnken法在最优提取条件下优化提取试验方案，Box-Behnken 试验因素及水平编码值见表1，超声提取时间为A 因素，提取温度为B 因素，乙醇浓度为C 因素，液料比为D 因素，试验设计编排组合共29个实验点，其中24 个析因点，5 个中心点。

表1 优化试验的因素水平表

（五）数据处理

用Excel 2019 进行绘图，SPSS24.0 进行统计计算，Design Expert 8.06 对响应面实验结果进行优化。

二、结果与分析

（一）单因素试验

1.提取时间

如图1 所示，微波辅助提取对混合植物配料总多酚提取量率的影响。超声时间从10 min 延长至50 min 的过程中，总多酚的提取量逐渐增加，从最开始的6.5247mg/g 到30min 时达到峰值，为12.4902mg/g，之后又逐渐下降，提取时间延长到50min 的时候，总多酚的提取量只有峰值的88.67%，这可能是因为随着提取时间的延长，超声波对多酚化合物等活性物质结构产生破坏，多酚测定值下降，因此选择30 min 作为响应面的中心点。

2.提取温度

如图2 所示，提取温度在40℃～60℃区间，总多酚的提取量与温度呈正相关，并在60℃的时候达到峰值。随着提取温度的升高，多酚提取量开始下降，在80℃时的得率仅有峰值的72.07%，低于40℃条件下的提取量。提取温度的升高有利于乙醇等溶剂与提取物进行物质交换，将多酚类物质浸出。由于多酚类物质具有较强的还原性，在浸出的过程中也存在氧化的过程，当浸出量低于氧化量时，则呈现总多酚提取量下降的情况，因此，选择提取温度60℃作为响应面的中心点。

3.乙醇浓度

如图3 所示，多酚提取量随乙醇浓度的升高而迅速提高，在乙醇浓度为60%时多酚提取量最大，继续提高乙醇的浓度，多酚的提取量开始缓慢下降，在乙醇浓度为70%时，得率是峰值的96.88%。由于高浓度乙醇对脂溶性成分有更好的溶出效率，挤占多酚的浸出空间，反而抑制了多酚物质的溶出，导致其提取率下降，这与冼丽清[10]的研究结果相近。由于50%浓度乙醇的多酚提取量是峰值的99.49%，相差无几，因此从经济性上考虑，选取50%浓度作为响应面的中心点。

4.液料比

如图4 所示，从10mL/g 开始，多酚提取量随液料比的提高呈现出先下降后升高再下降的趋势。在液料比为40 mL/g 时，混合植物配料的多酚提取量为11.3268mg/g，之后下降到峰值的88.61%；液料比在30mL/g 的情况下，多酚提取量为10.9658mg/g，达到峰值的96.81%，而液料比在20mL/g 的时候，多酚提取量为峰值的80.57%。考虑到过大的溶剂用量将增加杂质含量及后续烘干溶剂制备多酚浸膏的工作量和经济成本，因此，本次实验选取液料比30mL/g 作为响应面的中心点。

（二）响应面法优化提取工艺

对混合植物配料的多酚得率响应面试验结果见表2。将所得数据进行多元回归拟合，得到多酚得率（Y）与超声波提取各因素变量的二次回归方程模型：

表2 Box-Bohnken 法优化的提取实验方案

上述公式中，A 为提取时间(min)，B 为提取温度（℃），C 为乙醇浓度(%)，D 为液料比（mL/g）。

由Design-Expert 8.0 软件分析结果，对试验方差及拟合程度进行综合分析，方差分析见表3。对比表3 的F 值可知，各因素影响效果的显著性顺序为：D＞A＞C＞B。各因素的二次项均极显著，这与单因素影响效果不同，显著性顺序为：C2＞D2＞A2＞B2。影响润喉糖混合植物配料的总多酚提取量的因素主次为：D 液料比＞A 提取时间＞C 乙醇浓度＞B提取温度。为了检验方程的有效性，对超声波提取多酚的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏向回归系数进行检验，结果见表3。

表3 回归方程的方差分析

回归方程模型P＜0.0001，极显著，可预测不同提取条件下的多酚得率。失拟项P=0.2231＞0.05，不显著，说明上述总多酚提取的回归方程可良好契合试验操作，实验产生的误差较小。回归模型下，A、D、AB、A2、B2、C2、D2对总多酚提取量具极显著影响（P＜0.01）。C、AC、BC、BD 对总多酚提取量具有显著影响（P＜0.05）。回归方程总决定系数R2=0.9162，调整决定系数R2(Adj)=0.9056，说明方程的拟合状况良好，该回归方程可用于分析混合植物配料总多酚提取效果随着考察因素、水平变化的趋势及波动情况。

（三）响应面分析

如图5 所示，混合植物配料总多酚微波辅助提取各因素存在交互作用。图5（A）显示，提取温度和提取时间对总多酚提取量影响的响应面坡度较为平缓，且等高线均呈卵圆形且曲线间距较大；图5（B）显示，乙醇浓度和提取时间对总多酚提取量影响的响应面坡度较为陡峭，其等高线均呈椭圆形且曲线较为密集，表明乙醇浓度与提取时间的交互效应对总多酚提取量具有显著的影响。图5（C，D，E，F）显示，液料比与提取时间、液料比与提取温度、液料比与乙醇浓度的响应面坡度均陡峭，且等高线呈椭圆形且曲线较为密集，这些结果说明液料比对总多酚提取量的影响更明显，这与回归方程的方差分析的结果一致。液料比是影响混合植物配料中总多酚提取量的首要因素。

（四）验证试验

根据响应面分析所建立的数学模型，由Design-Expert.12 求解回归方程，得出最优的总多酚提取方案为：乙醇浓度52.08%，液料比为33.34，提取温度61.49 ℃，超声提取时间26.60min，总多酚的提取率13.1144mg/g。对最佳提取工艺条件进行3 次验证试验，测得润喉糖混合植物配料的多酚提取量为13.0682±0.3461 mg/g，与预测值误差小于1.0%，响应面模型与实际验证结果拟合情况良好。

三、结论与讨论

本研究以润喉糖的混合植物配料（甘草、胖大海、干生姜和单丛茶梗）中的总多酚提取量为原料，首先通过添加纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶（20：5：1）的复配酶溶液，在50℃下发酵2h，降解混合植物配料纤维，促进多酚类物质溶出。在单因素试验的基础上，利用Box-Bohnken 法优化超声波辅助提取多酚的工艺，获得该工艺的回归方程，方差分析表明该方程极显著，可用于分析因素、水平变化对多酚提取效果的影响。考察因素的显著性顺序为液料比＞超声提取时间＞乙醇浓度＞超声提取温度。试验确定的最优总多酚提取方案为：乙醇浓度52.08%，液料比为33.34，提取温度61.49 ℃，超声提取时间26.60min。在此工艺参数下，验证试验表明润喉糖混合植物配料的多酚提取量为13.0682±0.3461mg/g，接近预测提取量13.1144 mg/g，与预测值误差小于1.0%。说明实验模型预测结果较为可靠。响应面模型与实际验证结果拟合情况良好，可为优化混合植物配料的多酚提取，以及广东茶叶产业中的茶梗综合开发利用提供理论依据及数据支撑。