刘 艳顾 鹏叶 行梁春锦关雅今张映辉邹庆剑*顾为望*

(1.五邑大学生物科技与大健康学院,广东 江门 529020;2.江门市大健康国际创新研究院,广东 江门 592040;3.华南生物医药大动物模型研究院,广东省医学大动物模型重点实验室,广东 江门 529728;4.南方医科大学实验动物管理中心暨比较医学研究所,广州 510515)

人延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumaroylacetoacetate hydrolase,FAH)位于染色体15q25.1,主要在肝和肾中表达,是酪氨酸代谢通路最后一步的酶[1]。FAH缺失会导致其上游中间代谢产物在肝细胞中积累,并通过旁代谢通路转化为琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate,SAA)和琥珀酰丙酮(succinylacetone,SA)[2]。这两种代谢产物与其它蛋白的巯基结合,影响其功能,最终造成肝、肾损伤,形成I型遗传性酪氨酸血症(HT1)[3],大多数HT1患者在婴儿早期就会死于急性严重的肝肾功能衰竭[4]。HT1目前的治疗方法主要通过饮食、药物或肝移植治疗控制疾病,降低血酪氨酸及其代谢产物水平,减轻酪氨酸及其代谢产物对机体的损伤,目前没有简便且有效的治愈方法。

肝中的谷胱甘肽S-转移酶-Z1(glutathione Stransferase zeta 1,GSTZ1)是酪氨酸代谢通路的倒数第二个酶,属于谷胱甘肽硫转移酶(GST)超家族新成员。催化马来酰乙酰乙酸酯(maleylacetoacetate,MAA)异构化为延胡索酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetate,FAA)[5]。作为GST家族的一员,GSTZ1还能催化二氯乙酸盐(dichloroacetate,DCA)氧化生成乙醛酸,并可能参与外源α-卤酸代谢[6-7]。人GSTZ1基 因 定 位 于 人 类 染 色 体14q24.3,长度为10.9 kb[8],主要在肝中表达,编码216个氨基酸组成,分子量在24×103左右[9]。研究发现GSTZ1在肝细胞癌(HCC)中显著下调[10],提示GSTZ1的表达降低可能导致了细胞的活性增强,但具体机制未知。

HT1主要病因是FAH的功能缺失,酪氨酸代谢通路中其它酶的作用需要进一步了解。通过基因编辑分析各个基因对该疾病的影响,可以更好地了解该疾病的具体发病机制。然而,受到伦理道德的限制,很多研究无法直接在人体中进行,必须首先通过细胞以及动物实验对疾病做相应的研究论证。本研究拟通过建立FAH/GSTZ1双突变肝细胞模型,研究GSTZ1的敲除对FAH缺失所导致的肝损伤是否具有影响,进一步研究两个基因在肝损伤中的作用,以及探索新的HT1肝损伤治疗方案。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系

人正常肝细胞系LO2来自南方医科大学实验室,人胚肾细胞HEK293T、感受态细胞DH5α由本实验室保存。

1.1.2 载体质粒

LentiCRISPR V2和PX458载 体 均 购 自Addgene。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基(Gibco;C11995500BT)、胎牛血 清(Gibco;10270106)、Opti-MEM®(Gibco;1119701)、0.25%胰酶(Gibco;25200056);无血清细胞冻存液(新赛美生物科技有限公司;C40100);转染试剂lipofectamine 2000(Invitrogen;2004957);嘌呤霉素无菌溶液(Meilunbio;MA0318);全蛋白提取试剂盒(凯基生物;KGP250);蛋白BCA定量试剂盒(Biosharp;BL521A)、ECL化 学 发 光 试 剂 盒(Biosharp;BL520A);PVDF膜(Millipore;TPVH00011);GSTZ1单克隆抗体(Proteintech;14889-1-AP);FAH抗体(K004637P)、GAPDH抗体(K200057 M)、二抗羊抗兔(SE134)和二抗羊抗小鼠(SE131)、CCK8试剂(CA1210)、1%结晶紫染液(G1062)均购自Solarbio;T4 PNK磷酸酶(M0201 S)、BsmBI(R0580 L)和BbsI(00397116)限制性内切酶均购自NEB;T4DNA连接酶(TaKaRa;M0202 S);EdU检测剂盒(BBI;E607204-0100);基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN;DP304);无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN;DP117-TA)。

细胞培养皿、Transwell小室、离心管、细胞冻存管(Corning);CO2细胞培养箱、生物安全柜和NanoDrop 2000(Thermo Scientific);PCR扩增仪、电泳仪、凝胶自动成像仪、荧光定量PCR仪(Bio-Rad);超纯水仪(ELGA);低速离心机(Eppendorf);旋涡振荡器(QILINBEIER);倒置荧光显微镜(Nikon)。

1.3 实验方法

1.3.1 基因敲除载体构建

(1)GSTZ1位点基因编辑质粒的构建

通过GeneBank网站(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找人的GSTZ1基因组序列。在人GSTZ1基因第6号外显子(E6)上找到N20NGG的靶向序列,合成相应的两条互补的单链引物(表1),退火形成双链DNA片段。LentiCRISPR V2载体用BsmBI酶切,回收后与双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下,16℃进行连接反应。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后涂板,利用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA,并送测序分析。测序正确的质粒称为LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1,将用于细胞转染。

(2)FAH位点基因编辑质粒的构建

在GeneBank网站查找人的FAH基因组序列。在人FAH基因第7、8号外显子(E7、E8)上找到两个N20NGG的靶向序列,合成相应的两条互补的单链引物(表1),退火形成双链DNA片段。PX458载体用BbsI酶切,回收后与双链DNA片段在T4 DNA连接酶作用下,16℃进行连接反应。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后涂板,利用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA,并送测序分析,将序列正确的质粒(PX458-sgRNAFAH)用于细胞转染。

表1 基因编辑引导RNA引物Table 1 Design of primers for guide RNA construction

1.3.2GSTZ1基因敲除细胞的构建

(1)慢病毒包装

HEK293 T细胞培养基为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,培养条件为37℃、5% CO2。转染前1 d铺60%汇合度的HEK293 T细胞于60 mm培养皿中,24 h后进行转染,转染试剂为脂质体lipofectamine 2000,将LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1与包装质粒pMD2.G、pSPAX2按照质量比4∶1∶3的比例混合后转染HEK293 T细胞,8 h后换成新鲜培养基培养,于48、72 h后分别收集培养基上清液,3000 r/min离心5 min去除细胞碎片,0.45 μm滤膜过滤,并将病毒上清液分装为每管1 mL,-80℃冰箱保存备用。

(2)慢病毒感染LO2细胞

LO2细胞培养基为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,培养条件为37℃、5% CO2。慢病毒感染前1 d铺40%汇合度的LO2细胞于6孔板,12 h后加入1 mL的慢病毒上清液感染LO2细胞。

(3)摸索嘌呤霉素杀伤LO2细胞的最适工作浓度

将40%汇合度的LO2细胞铺于6孔板中,12 h后加入不同浓度梯度的嘌呤霉素(0、0.1、1、4.5 μg/mL)至细胞培养基中。48 h后观察细胞存活情况,选取细胞全部死亡的最低浓度为后续筛选的工作浓度。

1.3.3 筛选GSTZ1敲除细胞株

慢病毒感染LO2细胞2 d后,加含嘌呤霉素的培养基筛选。待对照组LO2细胞全部被杀死后,将感染慢病毒的LO2细胞用胰酶消化,利用有限稀释法将细胞稀释成每毫升100个细胞,取10 μL加入96孔板中继续培养。1周后待单个细胞长成细胞团后,消化传代继续扩增培养。取单克隆细胞株部分细胞提取基因组DNA,利用鉴定引物(表2)进行PCR扩增并测序分析。将具有目标基因突变的细胞株进行扩大培养和冻存保存。

1.3.4FAH基因敲除细胞株的筛选

将构建好的PX458-sgRNAFAH共转染进野生型(wild type, WT)LO2细胞和GSTZ1敲除的LO2细胞,转染试剂为lipofectamine 2000,转染过程按照说明书操作。转染12 h后,换成10%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养。48 h后,用胰酶消化,利用有限稀释法将细胞稀释成每毫升100个细胞,取10 μL加入96孔板中继续培养。一周后待单个细胞长成细胞团后,消化传代继续扩增培养。取单克隆细胞株部分细胞提取基因组DNA,利用鉴定引物(表2)进行PCR扩增并测序分析。将具有目标基因突变的细胞株进行扩大培养和冻存保存。

表2 基因编辑鉴定引物Table 2 Primers for gene editing identification

1.3.5 敲除细胞株功能学实验

(1)Western blot检测GSTZ1、FAH蛋白表达情况

收集细胞后,利用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白,取10 μL进行凝胶电泳。SDS-PAGE分离胶和浓缩胶分别按照浓度为10%和5%配制,电压为恒压80 V,30 min;120 V,40 min。再电转入PVDF膜,电流200 mA,120 min。5% BSA封闭2 h,GSTZ1、FAH的抗体以及GAPDH内参抗体作为一抗分别4℃孵育过夜。用TBST室温摇床洗膜4次,加入二抗后室温孵育1 h。最后加入ECL显色后,观察拍照。

(2)CCK8检测细胞增殖

将GSTZ1、FAH敲除细胞及亲本对照组细胞胰酶消化后计数,以每孔1×104密度铺至96孔板中,每个样品6个重复。同时以全培为空白对照,分别在0、6、12、24和48 h加入10 μL CCK8溶液,37℃避光孵育4 h。用酶标仪测定450 nm处的吸光度,用细胞的吸光度扣除空白对照的吸光度,得到相对吸光度值,并进行统计学分析。

(3)克隆形成实验检测细胞增殖

将GSTZ1、FAH敲除细胞及亲本对照组细胞胰酶消化后计数,以每孔1×103密度铺至6孔板中,正常培养14 d。待细胞长至肉眼可见的细胞克隆时,去除培养基,采用PBS轻柔清洗细胞两次后用4%多聚甲醛固定细胞15 min。然后弃去多聚甲醛,用清水清洗细胞表面,晾干后用1%结晶紫染色10 min。最后用清水洗净染液,于体视显微镜下计数。

(4)划痕实验检测细胞迁移

将GSTZ1、FAH敲除细胞及亲本对照组细胞胰酶消化后计数,以每孔5×104密度铺置6孔板中。待细胞长满后,使用200 μL枪头划痕细胞,洗去细胞碎片,换成2%胎牛血清的新鲜培养基继续培养。间隔72 h后再次拍照,计算细胞相对迁移距离比(0 h距离-72 h距离)/0 h距离。

(5)EdU分析

将GSTZ1、FAH敲除细胞及亲本对照组细胞使用EdU细胞增殖试剂盒评估其增殖能力。将60%汇合度细胞铺至24孔板中,12 h后换成1×EdU标记培养基继续孵育细胞2 h,采用PBS轻柔清洗细胞两次后用4%多聚甲醛固定细胞15 min,弃去多聚甲醛,利用PBS清洗细胞两次。按照说明书将1×反应缓冲液、催化剂溶液、TAMRA红色荧光溶液和缓冲添加剂按照一定比例配制成检测混合液,将其加入细胞中并室温避光孵育30 min,利用PBS清洗细胞。检测前,用PBS将Hoechst稀释成1×染色液,室温避光孵育30 min,用荧光显微镜拍照观察。

1.4 统计学方法

用Graphpad prism 8.0进行数据处理以及统计学分析,结果以平均数±标准差(±s)表示。组间比较采用t检验,P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 LO2细胞筛选条件测试

LO2细胞为正常人源肝细胞,目前还没有文献对其进行嘌呤霉素敏感性实验。我们在正常培养的LO2细胞培养基中设置了4组不同浓度梯度的嘌呤霉素,发现最高浓度4.5 μg/mL嘌呤霉素可在48 h杀死全部野生型LO2细胞(图1)。因此在后续实验中,筛选基因编辑细胞系均采用终浓度4.5 μg/mL的嘌呤霉素。

图1 LO2细胞对puromycin药物浓度的耐受测试Figure 1 Sensitivity of LO2 cells to puromycin

2.2 细胞敲除模型的构建

2.2.1GSTZ1基因敲除细胞株的构建

LO2细胞的GSTZ1基因敲除位点设计在基因的第6号外显子(图2A)。LentiCRISPR V2-sgRNAGSTZ1构建成功,并包装获得慢病毒颗粒,进而感染LO2细胞,获得10株细胞克隆。基因组PCR和测序显示除了野生型序列外,共有6种突变形式,从缺失1～35 bp不等(图2B)。其中克隆#6在gRNA靶位点删除了5 bp,导致移码突变,提前形成终止密码TAA(图2C),将会导致表达出截短的无功能的GSTZ1蛋白。将这个细胞克隆株进行扩大培养,作为后续实验使用。

2.2.2FAH基因敲除细胞株的构建

进一步在FAH基因的第7和第8外显子分别设计两个基因编辑靶位点。将两个基因编辑质粒共转染到野生型LO2细胞和GSTZ1突变的LO2细胞中。通过有限稀释法筛选,分别获得了6株细胞克隆,PCR和测序结果显示主要有7种突变形式,包括大片段删除(如删除159 bp和163 bp),以及单位点或双位点基因编辑(图2D)。野生型和GSTZ1突变的LO2细胞通过编辑都分别在FAH基因位点获得了159 bp大片段删除的细胞克隆(图2E)。将这两株细胞分别扩大培养,进行进一步鉴定实验。

图2 人GSTZ1和FAH双基因敲除LO2细胞株的建立Note. A, Schematic diagram of the design at human GSTZ1 gene locus. B, Genotype analysis of GSTZ1 knockout cell clones. C, Sequencing analysis at gene targeting sites in wild-type and gene-target cells. D, Schematic diagram of gene targeting site design at human FAH gene locus. E, Genotype analysis of FAH knockout cell clones.Figure 2 Establishment of LO2 cell line with human GSTZ1 and FAH dual-gene knockout

2.3 基因编辑LO2细胞株GSTZ1与FAH蛋白表达

首先对GSTZ1基因敲除细胞进行Western blot检测,发现与野生型对照组比较,GSTZ1基因敲除后,相应的蛋白无法检出(图3A)。随后检测野生型、单个基因敲除和双基因敲除细胞的FAH蛋白,发现FAH基因敲除后,细胞内源FAH蛋白不再表达(图3B)。结果说明通过基因编辑手段可以将LO2细胞中的GSTZ1和FAH基因进行单独和双敲除,实现相应蛋白的彻底失活。

图3 蛋白水平检测GSTZ1和FAH的表达Note. A, GSTZ1 protein detected by Western blot. B, FAH protein detected by Western blot.Figure 3 GSTZ1 and FAH protein test by Western blot assay

2.4 GSTZ1、FAH敲除对LO2细胞增殖能力的影响

CCK8细胞增殖实验显示GSTZ1、FAH基因敲除会显著的增加肝细胞的增殖速率(图4A)。进一步,我们利用克隆形成实验检测,同样发现敲除GSTZ1、FAH基因后,肝细胞克隆形成能力也明显增加(图4B～4C)。另外,我们还通过EdU染色实验再次证实GSTZ1、FAH基因敲除均显著增加LO2细胞的增殖能力(图4D～4E)。

图4 GSTZ1和FAH基因敲除对LO2细胞增殖能力的影响Note. A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial. B, Colony formation was determined by crystal violet staining. C, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay. D, EdU assay for different cell lines. E, percentage of EdU positive cells.Compared with WT, **P＜0.01,***P＜0.001, ****P＜0.0001.Figure 4 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the proliferation of LO2 cells

3个独立的测试方式均显示GSTZ1基因的敲除可大幅提高肝细胞LO2的增殖活性。FAH基因的敲除也能显著提高LO2细胞的活力,但提高幅度大大低于GSTZ1敲除。并且在FAH敲除细胞的基础上,敲除GSTZ1可进一步提高LO2细胞的增殖活力。

2.5 划痕实验检测细胞增殖能力

为验证基因敲除是否影响LO2细胞的迁移能力,我们利用划痕实验观察到72 h的GSTZ1敲除细胞株的相对迁移比为(0.4±0.012),是野生型LO2细胞的10倍(图5)。FAH敲除细胞株的相对迁移比为(0.2±0.014),显著高于野生型细胞株。GSTZ1和FAH双敲除细胞株的相对迁移比为(0.25±0.021),并且GSTZ1和FAH双敲除可进一步提高细胞迁移能力。

图5 GSTZ1和FAH基因敲除对LO2细胞迁移能力的影响Note. A, Cell migration was observed under a microscope. B, Quantitative determination of cell migration rate. Compared with WT, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the migration ability of LO2 cells

3 讨论

本研究成功构建了GSTZ1和FAH单个基因和双基因敲除肝细胞模型,并比较了不同基因编辑细胞在细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移能力等方面的差异。FAH和GSTZ1都是肝中酪氨酸代谢通路的关键酶[11]。FAH的缺乏会导致遗传性Ⅰ型酪氨酸血症,并且会增加肝细胞癌风险[12]。迄今为止,关于酪氨酸分解代谢的倒数第二个酶GSTZ1的研究较少。有研究报道GSTZ1序列变异引起轻度高琥珀酰丙酮血症,但没有肝功能障碍的证据[13]。GSTZ1缺乏导致GSH耗竭,随后氧化应激升高和持续的Nrf2激活,从而促进肝癌细胞的增殖。但目前为止,GSTZ1在人正常肝细胞中缺失对酪氨酸代谢通路的影响仍然没有确切研究。我们首次在人正常肝细胞中进行GSTZ1基因突变研究,发现GSTZ1蛋白功能的缺失对肝细胞活性具有提升作用,并且对FAH基因突变的肝细胞的活性也有改善作用。

通过对酪氨酸代谢通路的另一个关键酶——羟苯丙酮酸二加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)的研究,发现HPD基因敲除能够成功阻止因FAH基因缺失所导致的急性致死性肝损伤[14-15]。HPD基因阻断治疗可以有效促进酪氨酸代谢的重编程,并恢复该条代谢途径中TAT、HGD和GSTZ1的表达,进而减少肝的炎症反应和氧化应激反应。那么同样作为酪氨酸代谢通路上游的酶GSTZ1是否能达到HPD对酪氨酸代谢的重编程的效果?研究首次在人正常肝细胞LO2中敲除了GSTZ1和FAH基因,在FAH突变的基础上,进一步突变了GSTZ1,分别构建了FAH突变、GSTZ1突变和FAH/GSTZ1双突变肝细胞模型,Western blot证实基因突变导致相应蛋白缺失。进一步通过细胞增殖实验和细胞迁移实验,首次发现GSTZ1基因的敲除可增加FAH基因突变细胞的活性,并且研究发现FAH和GSTZ1双突变肝细胞比FAH突变肝细胞具有更强的增殖活性和迁移能力。由于FAH的突变,HT1患者肝细胞内积累大量有毒物质FAA,引起肝细胞损伤。此外,FAA还具有诱变作用,可导致HT1中所见的肝癌[16-17]。GSTZ1是低毒物质MAA转变为FAA的关键酶,由于GSTZ1敲除会激活其依赖的谷胱甘肽非酶通路,积累的MAA可以继续转化为FAA,相比于GSTZ1正常通路减少了有毒产物FAA的积累,因此对肝细胞活性和功能影响较小[18]。本实验中,我们发现FAH的敲除并不会造成LO2肝细胞的死亡,相反,细胞活性有一定程度的增强。我们推测FAH突变导致积累的毒素物质FAA和SA被释放到了培养基中,稀释了FAA对细胞毒性的作用;另一方面,FAH的缺失也会影响细胞周期,促进细胞增殖[4]。除此之外,本研究还发现肝细胞系LO2中敲除GSTZ1后细胞的增殖和迁移能力进一步增加,可能是由于毒性中间产物减少造成。另有其它研究证实GSTZ1基因是一个重要的抑癌因子,突变后也会促进细胞增殖[19]。

总之,我们的实验研究发现GSTZ1基因可能成为HT1治疗的潜在靶点。未来的研究可以进一步在HT1动物模型上开发针对GSTZ1的小分子抑制剂或基因编辑治疗,阻断FAA的形成,探索HT1疾病的治疗新方案。