李亚萍严 琳丁培炎臧宏刚阎文军

(甘肃省人民医院麻醉手术科,兰州 730000)

肺缺血再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)在临床上广泛存在,可发生在肺移植、肺切除、心脏骤停和肺栓塞中[1],LIRI是导致肺移植相关死亡的主要原因[2]。因此,探讨LIRI发病及治疗机制十分重要。舒芬太尼(sufentanil)是高特异 性μ受 体 激 动 剂[3],右 美托咪啶(dexmedetomidine)为新型高特异性α2肾上腺素能受体激动剂[4],这两种药物均用于辅助麻醉或术后镇痛。有研究表明,舒芬太尼可抑制肝缺血再灌注损伤的炎症反应和氧化应激[5],可以减轻失血性休克引起的急性肺损伤[6];右美托咪定可通过抑制caveolin-1下游信号传导来减轻大鼠的急性肺损伤[7],并能通过抑制RIPK3/MLKL通路来减轻大鼠离体肺缺血再灌注损伤[8]。然而右美托咪定复合舒芬太尼对LIRI的作用及机制尚不清楚。氧化应激和自噬是影响缺血再灌注损伤的重要机制[9-10],因此,本研究拟通过自噬和氧化应激探讨右美托咪定复合舒芬太尼对肺缺血再灌注损伤的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级30只8周龄健康雄性SD大鼠,体重(250±20)g,购于成都达硕生物有限公司[SCXK(川)2020-030]。试验在甘肃中医药大学[SYXK(甘)2021-0004]进行,整个实验中动物自由采食、饮水,每天12 h光照,温度约22℃左右。本动物实验经甘肃省人民医院医学伦理委员会审批(IACUC-2021-247),实验严格遵守3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

自噬基因光链3B(自噬基因光链3B,LC3B,ab192890)、自噬效应蛋白Beclin1(ab210498)、自噬蛋白5(autophagy protein 5,ATG5,ab108327)、βactin(ab8226)、核呼吸因子2(Nuclear respiratory factor-2,Nrf-2,ab62352)、血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1,ab52947)和核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP,ab139417)抗体均购自Abcam公司;TUNEL试剂盒(Vazyme,南京,中国,No.A112-01);SOD和MDA ELISA试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司;细胞核蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。EM-1400PLUS透射电镜(JEOL,Tokyo,日本);CKX41光学显微镜(Olympus,Tokyo,日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与造模

(1)LIRI模型

造模方法根据已有报道进行造模[11],改良的Eppinger法建造大鼠LIRI模型,步骤为:25%乌拉坦(4 mL/kg)腹腔注射,颈部游离右颈动脉及气管后气管插管,通气,通气频率每分钟75次,潮气量为10 mL,吸呼比为1∶2;待动物稳定后(约10 min),开胸,用无创血管夹夹闭左肺门30 min,关胸;30 min后,开放血管夹行缺血后复流60 min。夹闭肺门前,将左下肺韧带离断,50 U肝素尾缘静脉注射5 min。

(2)实验分组

实验分为5组,每组6只,分别为假手术组(Sham)、模 型 组(Model)、舒 芬 太 尼 治 疗 组(Sufentanil)、右美托咪定治疗组(Dexmedetomidine)和舒芬太尼+右美托咪定治疗组(Sufentanil+dexmedetomidine)。模型组、舒芬太尼治疗组、右美托咪定治疗组和舒芬太尼+右美托咪定治疗组大鼠均建立LIRI模型,在阻断左肺门前,分别给予20 μg/kg舒芬太尼、25.2 μg/kg右美托咪定和20 μg/kg舒芬太尼+25.2 μg/kg右美托咪定,再阻断30 min;假手术组仅开放胸腔一段时间,除不采取药物治疗和阻断左肺门外,其余处理相同。

1.3.2 检测内容

(1)HE染色

将肺组织用4%多聚甲醛固定后,按常规方式包埋、脱蜡至水、切片,然后用苏木精和伊红染色,通过光学显微镜观察染色结果。

(2)TUNEL染色

采用TUNEL试剂盒对肺组织凋亡进行检测。修复后,加入50 μL末端脱氧核苷酸转移酶反应混合物,在37℃避光孵育60 min。加入SSC溶液停止15 min,DAPI染色,在488 nm光照下可视化。

1.3.3 电镜检测

3%戊二醛溶液固定新鲜肺组织,然后用1%四氧化锇再固定。脱水切片后,醋酸铀染色10 min,再用枸橼酸铅染色1 min,通过透射电镜观察切片。

1.3.4 ELISA检测

根据ELISA试剂盒说明书检测肺组织SOD和MDA水平,最后在450 nm光照条件下观察光吸收值。

1.3.5 Western blot检测

提取总蛋白,分离核蛋白,核蛋白提取步骤为:加入细胞质蛋白提取剂裂解15 min,然后将样品在4℃下以1500 r/min离心10 min,收集沉淀,加入核蛋白提取剂,高速涡旋至沉淀完全分散,冰浴10 min。最后最高转速剧烈涡旋10 s,4℃ 12377 r/min离心10 min,上清液为细胞核蛋白。然后通过BCA蛋白试剂盒测定总蛋白和核蛋白含量。总蛋白检测LC3B、Beclin1、ATG5和HO-1蛋白水平,内参为β-actin;核蛋白检测Nrf-2蛋白水平,内参为PARP。Western blot步骤为:SDS-PAGE分离蛋白,将蛋白质转PVDF膜上,置于4℃下添加一抗,孵育过夜;洗涤后添加对应的二抗,常温下孵育2 h。显色后,基于内参对蛋白水平进行定量分析。

1.4 统计学方法

采用GraphPAD 8软件分析数据,数据用平均数±标准差(±s)表示,两组之间比较采用非配对T检验,3组及以上采用单因素方差分析,事后比较采用LSD方法检验,P＜0.05组间具有显著差异。

2 结果

2.1 右美托咪定复合舒芬太尼对LIRI大鼠肺组织病理学影响

假手术组大鼠肺组织各级支气管结构较为清晰,肺泡结构较为完整,未见其他明显病理变化。模型组大鼠肺组织结构受损,大量肺泡上皮细胞增生,肺泡壁明显增厚,肺泡腔狭窄甚至消失,支气管及血管周围间质炎细胞浸润,可见淋巴细胞团灶状聚集,出现大量细胞凋亡。舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治疗均造成模型大鼠肺泡壁增厚程度减少,肺组织受损程度减轻,细胞凋亡数目也减少,其中舒芬太尼+右美托咪定治疗组大鼠肺泡腔及间质内未见明显炎细胞浸润,细胞凋亡数目减少也最明显。这些结果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定对大鼠肺缺血再灌注损伤有保护作用,此外,20 μg/kg舒芬太尼复合25.2 μg/kg右美托咪定对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护有协同作用,见图1。

图1 通过HE染色和TUNEL染色观察右美托咪定复合舒芬太尼对大鼠肺缺血再灌注损伤的病理学影响Note. Compare with Model group, ***P＜0.001. Compare with Sufentanil+dexmedetomidine group, &P＜0.05, &&P＜0.01.Figure 1 Pathological effect of dexmedetomidine combined with sufentanil on pulmonary ischemia-reperfusion injury in rats were observed by HE staining and TUNEL staining

2.2 电镜观察右美托咪定复合舒芬太尼对LIRI大鼠肺组织细胞线粒体损伤的影响

电镜结果表明,与假手术相比,模型组大鼠肺组织细胞线粒体严重肿胀;舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治疗均减轻了模型大鼠肺细胞肿胀程度,其中舒芬太尼+右美托咪定治疗组大鼠肺细胞肿胀程度改善最明显,见图2。

图2 透射电镜观察肺组织细胞线粒体损伤情况Figure 2 Mitochondrial damage in lung cells were observed by transmission electron microscopy

2.3 ELISA检测右美托咪定复合舒芬太尼对LIRI大鼠肺组织氧化应激指标SOD、MDA表达的影响

与假手术大鼠相比,模型组大鼠肺组织SOD表达水平显著降低,MDA表达水平显著增高;经舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治疗后,三组大鼠肺组织SOD表达水平显著升高,MDA表达水平显著降低,其中舒芬太尼+右美托咪定治疗组在3个治疗组中,SOD表达水平最高,MDA表达水平最低,但与舒芬太尼治疗组和右美托咪定治疗组相比,没有显著差异。这些结果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定及其联合使用均对大鼠缺血再灌注肺损伤的氧化应激有抑制作用,此外,20 μg/kg舒芬太尼与25.2 μg/kg右美托咪定联合使用可能有更好的抑制氧化应激的效果,见图3。

图3 ELISA检测肺氧化应激指标SOD、MDA的表达Note. Compare with Model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 3 Expressions of SOD and MDA in lung were detected by ELISA

2.4 Western blot检测右美托咪定复合舒芬太尼对LIRI大鼠肺组织自噬及氧化应激Nrf-2/ARE通路相关蛋白表达的影响

与假手术大鼠相比,模型组大鼠肺组织LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋白表 达 以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增高,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表达降低;经舒芬太尼、右美托咪定和舒芬太尼+右美托咪定治疗后,三组模型大鼠肺组织LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋 白 表 达 以 及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比 值 降 低,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表达增加,其中舒芬太尼+右美托咪定治疗与其他两个治疗相比,LC3B-Ⅱ、Beclin1、ATG5蛋白表 达 以及LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值显著降低,LC3B-Ⅰ、Nrf-2、HO-1蛋白表达显著增加,但舒芬太尼治疗组和右美托咪定治疗组之间比较,没有显著差异。这些结果表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定及其联合使用均能抑制大鼠缺血再灌注肺损伤引起的自噬,及激活Nrf-2/HO-1抗氧化应激通路,20 μg/kg舒芬太尼与25.2 μg/kg右美托咪定在联合使用中具有协同作用,见图4。

图4 Western blot检测肺组织自噬及氧化应激Nrf-2/ARE通路相关蛋白的表达Note. A, Total protein related index detection. B, Nuclear protein related index detection. a, Sham. b, Model. c, Sufentanil. d,Dexmedetomidine. e, Sufentanil+dexmedetomidine. Compare with Model group,**P＜0.01,***P＜0.001. Compare with Sufentanil+dexmedetomidine group, &&P＜0.01,&&&P＜0.001.Figure 4 Related proteins of autophagy and oxidative stress Nrf-2/ARE pathway in lung were detected by Western blot

3 讨论

已有研究表明舒芬太尼与右美托咪啶联合用药存在一定的药物协同作用,可延长镇静作用和呼吸抑制作用的持续时间[12],并可通过调节脑脊液β淀粉样蛋白Aβ、p-Tau蛋白含量和海马组织中凋亡相关蛋白Casepase-3、Bax的表达有效保护体外循环手术大鼠认知功能[13]。我们的研究表明,舒芬太尼与右美托咪啶联合用药在改善LIRI中也存在一定的药物协同作用,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路抑制肺组织氧化应激,并抑制非细胞过度自噬,改善肺细胞凋亡有关。

LIRI已被证明可降低肺组织中Bcl-2的水平并增加裂解的Caspase-3的水平,从而激活肺细胞凋亡[14-15]。过度的肺细胞凋亡会损害上皮屏障并导致急性肺水肿[16]。本研究发现20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均对大鼠肺缺血再灌注损伤有保护作用,可抑制LIRI诱导的肺泡壁增厚,并减少炎细胞浸润和肺细胞凋亡。此外,20 μg/kg舒芬太尼复合25.2 μg/kg右美托咪定对LIRI大鼠肺组织的保护作用优于这两个药物的单独使用,表明20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护有协同作用。

氧化应激是缺血再灌注损伤的重要机制,LIRI产生的活性氧和促炎因子直接决定移植肺的状态,可导致移植肺组织凋亡[9]。在病理状态下,活性氧ROS会过度产生,从而导致氧化应激,氧化应激可导致线粒体肿胀并启动凋亡级联反应[17]。为应对氧化应激,Nrf2进入细胞核并激活抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)以增强抗氧化防御。Nrf2/HO-1通路是参与氧化应激调控的重要途径:Nrf2通过HO-1的作用调控线粒体活动[18],HO-1是Nrf2的靶向基因,受Nrf2信号激活的严格调控,HO-1增强了内源性一氧化碳的生成,从而允许Nrf2与Nrf1启动子中的ARE结合,导致编码线粒体发生基因诱导[19],因此激活Nrf2/HO-1通路可以保护细胞免受氧化应激诱导的损伤[20]。研究表明舒芬太尼可能通过调节KNG1介导的NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路来保护肺组织免受败血症诱导的炎症和氧化应激损伤[6]。本研究表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能激活Nrf2/HO-1信号通路、提高SOD表达和降低MDA表达,减轻线粒体肿胀损伤,表明20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能抑制LIRI大鼠肺组织氧化应激,改善线粒体损伤,从而减少LIRI大鼠肺细胞凋亡。此外,20 μg/kg舒芬太尼与25.2 μg/kg右美托咪定联合使用对LIRI抗氧化应激具有协同作用。

氧化应激可触发线粒体自噬[21]。尽管自噬的作用在缺血再灌注损伤中存在争议,但普遍认为适度自噬具有保护作用,而过度自噬可能导致缺血期间细胞死亡[10]。Liu等[22]发现小型猪肺缺血再灌注损伤(I/R)后多种自噬相关基因上调,并且肺I/R损伤后粗肺组织和分离的肺泡巨噬细胞中自噬通量被激活。一项研究还发现,自噬通量在肺缺血期间被激活,在大鼠再灌注期间进一步增加[23]。以上表明再灌注损伤可能是自噬失调的结果[24]。此外,一项研究表明,右美托咪定可以通过抑制自噬减轻大鼠离体肺缺血再灌注损伤[25]。本研究表明,20 μg/kg舒芬太尼和25.2 μg/kg右美托咪定均能抑制LIRI大鼠肺组织自噬,且20 μg/kg舒芬太尼与25.2 μg/kg右美托咪定联合使用对LIRI大鼠肺组织自噬抑制有协同作用。此外,舒芬太尼和右美托咪定及其联合使用抑制自噬的作用可能与LIRI大鼠肺组织降低的氧化应激水平相关。