盛曹颖

（吴江高级中学 江苏苏州 215200）

在基因工程中，外源基因自身很难进入宿主细胞，且在宿主细胞内不能进行正常扩增、表达，许多载体便应运而生。科学家根据其完成的不同生物学效应，将其分为以下几种：①克隆载体（cloning vector），又称一般载体，一般在宿主外不能存活，有能自我复制、分子量小、拷贝数多等特点，主要用于扩增外源DNA片段；② 表达载体（expression vector），一般具有高强度的启动子和核糖体的结合序列，能高效地产生较稳定的mRNA，主要用于外源DNA在宿主细胞内的高效表达；③穿梭载体（shuttle vector），可用于不同生物间复制。

在这些载体中，克隆载体是最常见的载体，在基因工程中占有十分重要的地位。目前，科学家已构建和应用的克隆载体有数千种。根据其构建所用的DNA来源，克隆载体可分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体载体等。

1 质粒载体

质粒（Plasmid）是人们广泛应用的克隆载体。它是细菌和真菌等细胞内独立存在的一种环状DNA分子。几乎所有的质粒都带有一个或多个基因。质粒不影响宿主细胞的生存，但其带有特殊功能的基因可以赋予宿主细胞某些抵御外界不利环境因素的特性。

1.1 质粒的生物学特性

1.1.1 质粒的复制

几乎所有的质粒都含有复制起点。质粒侵染宿主细胞后，不同质粒复制的方式不同。根据是否携带一套促进DNA转移相关的基因（称为基因），质粒分为整合型质粒和非整合型质粒。整合质粒可以整合到宿主细胞染色体的DNA上进行复制，而非整合质粒依赖于自身或宿主细胞体内编码的酶进行自主复制而实现扩增，具体过程如图1所示。

图1 非整合质粒和整合质粒的复制过程模式图

1.1.2 质粒的大小和拷贝数

质粒的大小一般在1～250 kb之间。但是，科学家发现一般小于10 kb的质粒才适合用于构建克隆载体，而大的质粒经过一定的改造后亦可用于基因克隆。质粒拷贝数是指在某一生物组中能够找到质粒的分子数，目前对控制拷贝数的因素尚未了解，但发现每个质粒具有的拷贝数在1～800之间。一般来说，一个可以应用于实践的克隆载体需要以大量的拷贝形式存在于细胞中，才能够获得大量的重组DNA。表1列出了几种常用质粒的大小与拷贝数的关系。

表1 常用质粒载体大小与拷贝数的关系

1.1.3 质粒的不相容性

质粒的不相容性是指利用同一复制系统的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。其原因主要是在同一细胞中复制时，一般不相容的质粒具有相同的复制子，会存在竞争，从而随机被淘汰，导致在子细胞中只存在其中一种质粒。

1.1.4 质粒的转移性

质粒的转移性是指在自然条件下，质粒通过细菌接合作用可以转移到新宿主细胞内。有些质粒（如质粒pBR322）本身不能进行结合转移，但含有转移起始位点nic，借助于第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白的作用，通过结合质粒来进行转移。基因操作中可以在不同的复制单位上放入转移必需的因子，通过顺反互补来控制目的质粒的接合转移。

1.2 质粒载体的种类

按照不同的方式，质粒分类不同。质粒的基因所决定的主要特征是天然存在的质粒最主要的分类依据。根据这一分类方法，质粒可分为以下5种：①致育质粒，又称F质粒，仅携带转移基因，只具有促进质粒间有性接合转移的特征，如大肠杆菌中的F质粒；②药性质粒，又称R质粒，携带有能够赋予宿主细菌对某一种或多种抗菌剂的耐药性基因，如抗氯霉素、氨苄青霉素或水银；③Col质粒，编码一种能够杀死其他细菌的大肠杆菌素蛋白，如大肠杆菌的ColE1质粒；④降解质粒，使宿主菌能够代谢一些通常情况下无法利用的甲苯、水杨酸等分子，如恶臭假单胞菌中的TOL质粒；⑤毒性质粒，赋予宿主菌致病性，如根瘤农杆菌中的Ti质粒，能够在双子叶植物中诱导冠瘿瘤。

1.3 质粒载体的构建

由于野生质粒往往存在许多缺陷，因此目前使用的质粒载体大多是人工构建的。每种质粒的构建思路和过程都十分相似，都是根据基因工程的需要，除去一些非必需元件，添加一些必需的元件，使其成为一种带有多个单一限制酶切位点、多种强选择标记、低分子质量、高拷贝、易于转化、无感染性等优点的理想载体。

1.4 质粒载体的应用

由于这类载体可以在细胞内维持较高的拷贝数，有利于扩增外源DNA，所以具有非常广泛的应用。例如，早期的pBR系列载体以及现在实验室常用的Takala公司的pMD18-T载体等。这些载体可以把经过PCR扩增或经聚合酶处理3′末端加A的未知序列的DNA片段直接通过T-A克隆的方法插入载体，为载体构建和未知DNA序列的鉴定提供了更加简洁的解决方案。

2 噬菌体载体

与质粒相比，噬菌体结构要复杂些，虽然它们均可用于克隆和扩增特定的DNA片段，但是利用噬菌体感染细胞比质粒转化细胞更为有效，且克隆容量也明显大于质粒，已成为一种不可或缺的基因载体。

2.1 噬菌体载体的生物学特性

噬菌体是一类细菌病毒的总称，不同种类的噬菌体颗粒在形态结构上差别很大，其感染性强，依赖于细菌宿主细胞才能进行生长、繁殖。

2.2 噬菌体载体的种类

目前使用的噬菌体载体主要分为：①λ噬菌体衍生物，是最早使用的克隆载体，分为插入型载体和置换型载体两类。②柯斯质粒，是λ噬菌体cosDNA序列与细菌质粒复制原点DNA序列重组而成，具有两种载体的优点。③单链M13噬菌体，作为单链DNA载体，可用于基因定位诱变以及单链DNA探针制备。

2.3 噬菌体载体的构建

由于野生型的噬菌体DNA中含有较多的限制位点，不适合作为基因克隆的载体。因此，构建噬菌体载体时需要切除多余的限制位点以及非必需的区段，才能将其改造成适用的克隆载体。不同的噬菌体载体构建方式不同，λ噬菌体衍生物主要集中在消除多余的限制性酶切位点和去除λDNA中一些对其生命周期无关的非必需区段；单链M13噬菌体先插入一个大肠杆菌的lac操纵子片段和选择标记，再加入多克隆位点MCS。

2.4 噬菌体载体的应用

噬菌体载体主要用于建立cDNA文库，具体过程是先将某种生物的一系列cDNA分子先通过置换或插入的方法与合适的噬菌体载体重组，或不经过包装直接转染受体菌细胞，或在体外包装成噬菌体颗粒后转导受体菌细胞。这样所形成的噬菌斑群体就是该生物个体的cDNA基因。除此之外，噬菌体载体还可用于克隆外源目的基因，在生化和遗传学研究中有着非常广泛的应用。

3 病毒载体

3.1 病毒载体的生物学特性

病毒复杂而精致的结构可以高效转染宿主细胞，并在细胞内进行复制和表达，这是作为载体的基础。在外源基因导入真核受体细胞的各种方法中，最为常用的便是利用病毒载体感染宿主细胞的途径，不同的病毒载体具有不同的表达特点。目前常用的介导基因转移的病毒有腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和痘病毒等。

3.2 病毒载体的种类

病毒表达载体大体可分为病毒颗粒载体（插入外源性DNA后，随病毒的繁殖进行复制和表达）和改建的病毒DNA混合型载体（不能形成病毒颗粒，重组体在真核细胞内像质粒一样随宿主细胞的基因复制而复制）。其中后者是目前广泛使用的。

3.3 病毒载体的构建

目前，科学家已研究出多种病毒载体，特别是腺病毒载体和逆转录病毒载体，其构建过程首先对病毒的基因组进行改造，使之能携带相关的病毒元件和外源基因，之后包装成重组病毒载体，进行侵染。

3.4 病毒载体的应用

由于病毒载体可以介导外源基因在真核细胞中高效表达，可以用于实验室基础研究，如建立特定基因瞬时或稳定表达的细胞系，也可以表达治疗性基因用于临床基因治疗，如治疗Duchenne型肌营养不良症和B型血友病。

4 人工染色体载体

4.1 人工染色体载体的生物学特性

当克隆基因组非常庞大的人类基因组等真核生物基因组时，往往需要克隆几百甚至数十万碱基对的DNA片段。此时，克隆载体需要具备更大的承载量，科学家便建构了人工染色体载体。人工染色体载体具备着丝粒、端粒和复制起始区域三种必需成分，才能保证其能在宿主细胞内稳定地自主复制、分离，并随细胞分裂平均分配到两个子细胞中，从而保证人工染色体在宿主细胞中的稳定性。

4.2 人工染色体载体的种类

人工染色体载体含有天然染色体基本功能单位，目前科学家已开发出多种类型的人工染色体载体，实验室常用酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、人类人工染色体（HAC）等。

4.3 人工染色体载体的构建

不同种类的人工染色体载体的构建不同，但是大体原理相同，如将细菌接合因子、酵母或人类染色体DNA上的复制区、分配区、稳定区、端粒区与质粒装配在一起。

4.4 人工染色体载体的应用

人工染色体载体主要应用于基因分离、基因组图谱制作以及基因组序列分析，并且在基因治疗领域有很好的应用前景。例如，基因治疗过程中，较大的外源DNA片段和人工染色体重组成功后，通过电穿孔技术导入宿主细胞，重组体在宿主细胞内作为一条独立的染色体进行复制和分裂，并在宿主细胞中表达出正常功能的蛋白，以治疗由于基因缺陷或基因突变导致的遗传疾病。