周桂仙，黄 云，刘洪艳，汤德元，曾智勇，王 彬，林 泠，黄 涛

（贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

随着养牛业的发展，牛呼吸道疾病的流行，引起人们的关注。牛传染性呼吸道疾病通常是由单一或多种病原引起，常有不同病原混合感染，包括原发性感染和继发性感染，该原发性疾病通常由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛疱疹病毒1型(Bovine herpes virus-1，BHV1)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、牛副流感病毒3型（Bovine parinfluenza-3 virus，BPIV3)、牛冠状病毒(Bovine corona viru-ses，BCoV）等病毒和支原体（Mycoplasma bovis，MB）、胸膜肺炎放线杆菌及支气管败血性波氏杆菌等细菌引起，继发性疾病主要由肉牛链球菌2型、副牛嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、牛附红细胞体等病原引起。在同一个牛场中，上述原发性病原发生流行感染，又同时继发其它病原感染，可使病牛的临床症状加重，引起较高的感染率和死亡率，并造成严重的经济损失。

本研究运用RT-PCR/PCR技术与细菌分离方法对该牛场病死牛肺脏进行病原析，并对分离菌进行药敏试验，以期了解该牛场呼吸道疾病发病情况、牛支原体流行菌株对抗生素敏感程度情况，为牛支原体、病毒性腹泻混合感染的治疗防控提供理论依据。

1 发病情况及临床症状

2020年12月贵阳某牛场西门塔尔杂交牛群相继出现精神沉郁不振、食欲减退、部分出现食欲废绝、消瘦、腹泻、流涕流涎，口腔出现溃疡，并有白色泡沫流出，咳喘等临床症状。发病后该养殖场曾使用青霉素、硫酸链霉素、磺胺嘧啶钠等药物治疗，无明显好转，随后病重牛很快死亡。出现相关症状发病牛14（14/48）头，死亡2头。

2 实验室检查

2.1 样本采集及处理无菌采集病死牛肺脏病料组织及有呼吸道症状牛的鼻黏液14份，冷藏箱冷冻保存待用。

2.2 分子生物学鉴定检测

2.2.1 PCR检测引物设计 根据NCBI中发表的BVDV 5-UTR(MK059454)、MB uvrC（AF003959)基因序列，运用Primer5.0设计引物，用于扩增目的基因片断。其他引物设计参考石柯等发表文献详（见表1），引物由武汉擎科创新生物公司合成。

表1 引物序列和片段长度（引自石柯等参考文献）

2.2.2 PCR和RT-PCR扩增 病料磨碎处理，用总DNA/RNA抽提试剂盒（购自TAKARA公司）提取病料核酸反转录后。进行目的基因的扩增。反应体系及条件，PCR反应体系为25μL，金牌Mix(green)21μL(购自北京擎科生物科技有限公司)，上下游引物各1μL，DNA或cDNA模板各2μL，PCR反应条件为：94℃5 min（预变性）；94℃45s（变性），退火54℃45s，72℃30s（延伸），共进行35个循环；72℃10min（延伸）。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2.2.3 病料样品的细菌支原体分离鉴定 将无菌采集的肺脏组织研磨粉碎，无菌接种于绵羊血琼脂营养平板，37℃恒温培养24～48h，观察生长情况镜检。将采集的肺脏组织研磨粉碎，支原体专用液体培养基稀释后无菌接种支原体固体培养基，5%CO2恒温培养箱中37℃培养2～3d，显微镜下观察菌落形态。牛支原体分离培养参考贾伟强等的研究进行。

2.3 药敏试验选取青霉素、硫酸链霉素、头孢噻吩、泰妙菌素、庆大霉素、红霉素泰乐菌素、强力菌素、左氧氟沙星、氨苄西林等多种药物对分离得到的病原体进行药敏试验，测量抑菌圈直径，并与相应产品说明书中标准参照比对判断药物的敏感性。

3 结果与分析

3.1 分子生物学鉴定采用RT-PCR/PCR方法对各个病牛的样品进行检测，部分样品检出牛支原体和病毒性腹泻特异性目的基因，而未检测到其他目的基因，结果如图1所示，2、4、5、11号样扩增产物在527bp处出现清晰条带，与预期相符合，表明感染牛支原体。8、13号样扩增产物在139bp出现清晰条带，与预期相符合，表明感染牛病毒性腹泻病毒。

图1 牛病毒性腹泻病毒、牛支原体基因PCR扩增产物电泳结果

3.2 细菌和支原体分离鉴定结果经过培养48h的麦康凯和血琼脂培养基上未见菌落生长。经过

2～3 d培养，支原体固体培养基上长出肉眼可见针尖大小的菌落，在显微镜下观察可见典型的煎蛋样菌落。

3.3 药敏试验药敏试验结果（见表2），支原体分离株对左氧氟沙星、泰妙菌素、泰乐菌素、土霉素、环丙沙星、卡那霉素、多西环素、强力菌素等敏感；氨苄西林、头孢噻吩等中度敏感，对青霉素类、硫酸链霉素、红霉素、庆大霉素不敏感。

表2 药敏试验结果 单位：mm

3.4 诊断和防治根据发病情况、临床症状、实验室检查，结果显示，该牛场呼吸道疾病是由于牛支原体、病毒性腹泻病毒混合感染引起。建议对整个牛场进行全面消毒，对场内动物垫草、粪便等污染物进行无害化处理。临床治疗可以结合药敏试验结果选择左氧氟沙星，土霉素，环丙沙星，泰妙菌素等治疗，同群牛使用BVDV灭活疫苗紧急免疫注射。

4 小结与讨论

4.1牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能引起牛的呼吸道症状，各年龄段的牛都是易感群体、其中以犊牛最易感，BVDV为呼吸道疾病的原发性病原，也常和其他病原混合感染，石柯等人对贵州省部分牛场BVDV、BHV-1、BCoV、MB的感染情况调查，结果显示BVDV阳 性 率16.07%（36/224）、MB阳 性 率12.90%（9/224）。感染病牛的急性型临床症状表现为高热，持续2～3d，有的呈双相热型，随后出现腹泻，粪质稀薄呈水样，并带有粘液和血丝，大量流涎、流泪，口腔黏膜、唇内、齿龈和硬腭和鼻黏膜糜烂或出现溃疡，严重者整个口腔覆有灰白色的坏死上皮。在继发感染牛支原体后，能引起肺脏炎症，还能引起关节炎、结膜炎、乳房炎等，严重威胁养牛产业的可持续发展。

4.2牛呼吸道感染是一类危害严重的疾病，通常是由单一病原感染或混合感染引起的，牛病毒性腹泻病毒和牛支原体常有混合感染，严重危及养牛业的可持续健康发展。临床症状包括呼吸道炎症、厌食和呼吸困难。该病主要危害犊牛和育肥牛，发病率高，给养殖场带来很大损失。某些病原体可破坏牛的固有层细胞，导致支气管炎和病原微生物的感染使病情加重，对牛的健康危害极大，牛病毒性腹泻病毒是引起呼吸道疾病的主要原因之一，容易和其他病原混合感染。随着我国养牛业的迅速发展，国外品种不断引进，该病在我国发生、流行呈上升趋势。早在20世纪60年代，我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发生。目前，该病在贵州也普遍存在。因此在养殖过程中，要更加注重防治，有效地控制其蔓延，做好防制工作，减少BVDV对贵州省养牛业造成的损失。

4.3牛支原体是引起呼吸道疾病的病原之一，常和牛病毒性腹泻病毒等病原形成混合感染。因此，通常需要抗菌药物和抗病毒药物一起使用，避免使用对病原体无效或治疗效果不佳的抗菌药物。用药前了解病原菌的药敏性，确保用药准确，避免药物滥用造成机体形成抗性。根据本次药物敏感试验结果，选择合适的抗生素进行控制。该牛场支原体分离株对左氧氟沙星、泰妙菌素、泰乐菌素、土霉素、环丙沙星、卡那霉素等敏感，对青霉素类、硫酸链霉素不敏感，因此临床治疗可以结合药敏试验结果选择左氧氟沙星、泰妙菌素、土霉素等治疗及防止继发感染，同群牛注射BVDV灭活疫苗免疫注射。

4.4预防和控制呼吸系统混合感染疾病对贵州养牛产业的整体发展特别重要。对于动物疫病的防控应坚持防大于治的原则，平时应注意加强饲养，引入新品种时应对其来源地进行调查，在引进其他牛种时应及时进行检疫隔离，不能在疫区引进牛种，如果出现病死牛要及时进行科学的无害化处理，避免出现病毒传播或者蔓延。在本病的常发区，应该做好圈舍周围环境的灭蝇工作。加强群体免疫，疫苗的接种可从根源上避免牛病毒性腹泻的感染。呼吸道病原较多，由于缺乏特定的疫苗和药物，这使得牛呼吸道疾病预防和控制受到影响，因此在防治牛呼吸道疾病方面更应该加强饲养管理，从源头解决问题，根除病因。