刘耀川，龚商羽，关 淼，杨扬，申贯男

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164；2.锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

大肠杆菌是存在于人和动物肠道内的一种固有细菌，大多分布于大肠内。绝大多数情况下，机体内的大肠杆菌不表现出致病力，但当机体处于外伤、感染等免疫力低下时，大肠杆菌则转变为条件性致病菌。近年来随着研究的不断深入，又发现多种致病性大肠杆菌。因该菌分布广泛且极易传播，是公共安全的潜在威胁因素。猪感染致病性大肠杆菌后会引起仔猪腹泻、败血症、脑膜炎等多种感染性疾病，给养猪业造成巨大经济损失。目前兽医对大肠杆菌感染通常使用抗生素治疗，但随着抗生素的不断使用，大肠杆菌逐渐产生耐药性，给临床疾病治疗造成困难。

本研究对辽宁沈阳某生猪养殖场开展大肠杆菌分离、鉴定，并对确定的大肠杆菌分离株进行了抗生素敏感性试验。为该场由大肠杆菌引起的相关疾病治疗方案提供技术支持，同时也为该场大肠杆菌防控奠定基础。

1 材料

1.1 样品来源在沈阳市某生猪养殖场，选取腹泻病猪100头（其中仔猪50头、育肥猪50头）。采样猪均与其他健康猪相同条件饲养、免疫，且均未进行药物治疗。

1.2 主要仪器立式蒸汽高压灭菌器（泰田BT-27LD）、恒温振荡生化培养箱（华育HS-D60）、恒温隔水式培养箱（天松-60KD）、无菌工作台（SJ-3084S）、50μL、100μL、200μL微 量 移 液 器（ThermoFisher F3）、游标卡尺等由辽宁省动物疫病预防控制中心提供。

1.3 主要材料普通营养肉汤培养基（NB）、普通固体营养琼脂（NA）、麦康凯琼脂粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管购于杭州滨和微生物试剂有限公司；抗菌药物药敏纸片（10种）购于杭州微生物试剂有限公司、大肠杆菌质控菌标准株（ATCC25922）购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

2 方法

2.1 样品采集对采样猪进行恰当保定后，对肛门部位按照碘酊-酒精-碘酊的顺序进行消毒。用无菌棉拭子插入肛门对肠内容物进行蘸取采样。采样结束后将棉拭子头保存于的5mL离心管中。将标记好的离心管置于4℃样品冷藏保存盒中尽快送至实验室。

2.2 培养基制备按产品说明说要求，用灭菌dd H2O配置相应浓度的培养基，并将培养基于高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。用5mL离心管分装NB肉汤培养基，用90mm培养皿制作普通营养琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基。将制作好的培养基放置于隔水电热恒温培养箱中，37℃培养12h，观察培养基，无菌落生长、无浑浊的为检菌合格。将检菌合格的培养基置于4℃冰箱中保存待用。

2.3 大肠杆菌初步分离在洁净工作台中，用荡混匀仪对盛放肛门棉拭子头的离心管进行充分震动、混匀，取其中的生理盐水混匀液100μL接种于检菌合格的NB肉汤中。将NB肉汤放置于37℃恒温振荡培养箱中，180min转培养12h。

取100μL扩增后的NB肉汤，在洁净工作台中用三角玻璃棒将其均匀涂布于检菌合格的普通琼脂培养基中，正置片刻待菌液完全吸收后倒置于37℃隔水恒温电热培养箱中培养18h。选取大小、形态、生长特性不同的单独菌落，于NB肉汤中扩增。

取100μL单独菌落培养NB肉汤，用同样的方式涂布于检菌合格的麦康凯琼脂平皿中，过夜培养并记录培养结果。

2.4 大肠杆菌生化反应鉴定观察培养后的麦康凯琼脂培养基，选取其中具有金属红色光泽、圆形、独立生长的单独菌落。在洁净工作台中，按照生化反应鉴定试剂盒套装说明书要求，对其进行生化反应鉴定。细菌接种于微量鉴定管后，用注射器加入液体石蜡封闭，并用封口膜封口，放置于37℃培养箱中培养12h。

2.5 药物敏感性测试将鉴定后的大肠杆菌分离株NB肉汤培养液100μL均匀涂布于检菌合格的固体琼脂平皿中，待菌液完全吸收后用镊子将药敏纸片均匀放置于平皿内。药敏纸片间应预留出足够距离，以便测量抑菌环直径。将平皿放置于37℃恒温培养箱内过夜培养，用游标卡尺对抑菌环直径进行测量。取3次测量结果的平均值为该药物对病原菌分离株的抑菌直径，并与参考值进行比较，评估病原分离株对药物的敏感性。

3 结果

3.1 大肠杆菌初步分离结果100份棉拭子样本，经并病原菌NB肉汤扩增、普通琼脂培养基单独分离、麦康凯鉴别培养基鉴别培养，共得到大肠杆菌疑似分离株82株。其中在50份仔猪肛门棉拭子样本中得到疑似分离株48株、在50份育肥猪肛门棉拭子样本中得到疑似分离株34株。

3.2 大肠杆菌生化反应鉴定结果82株疑似大肠杆菌分离株经肠杆菌科细菌生化鉴定管反应，并根据培养后的颜色反应对其进行赋码、比对，最终确定大肠杆菌分离株61株，大肠杆菌的总体分离率为61%（61/100）。其中仔猪病例样本中得到大肠杆菌39株，育肥猪病例样本中得到大肠杆菌22株，其分离率分别为78%（39/50）及44%（22/50）。

3.3 大肠杆菌分离株药物敏感性结果对61株临床分离的大肠杆菌分离株及1株质控菌标准株进行药敏纸片法测定其药物敏感性，当质控菌抑菌环直径在标准范围内时，认定实验数据可信，记录并统计分离株耐药性情况。结果表明，61株临床分离株对10种受试抗生素耐药性由高至低分别为磺胺甲基异恶唑、阿奇霉素、红霉素、四环素、复方新诺明、强力霉素、青霉素、头孢曲松、氨苄青霉素及头孢拉定，耐药率（见表1）。

对不同样本来源得到的大肠杆菌进行分析，其耐药情况也不尽相同。在39株仔猪源大肠杆菌中，耐药性由高到低分别为磺胺甲基异恶唑、阿奇霉素、头孢曲松、红霉素、四环素、复方新诺明、强力霉素、青霉素、氨苄青霉素及头孢拉定，耐药率（见表1）在22株育肥猪源大肠杆菌中，耐药性由高到低分别为磺胺甲基异恶唑、红霉素、四环素、阿奇霉素、青霉素、复方新诺明、强力霉素、氨苄青霉素、头孢拉定及头孢曲松，耐药率分离株对10种受试药物敏感性测试结果（见表1）及（图1）。

图1 大肠杆菌药物敏感性试验结果

表1 大肠杆菌药物敏感性试验结果

4 讨论

近年来发现多种致病性大肠杆菌如肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠聚集性大肠杆菌（EAggEC）及肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等，不仅对养殖业危害巨大，也威胁人类健康。该病病原广泛、发病率高、症状复杂且极易造成病猪死亡，给生猪养殖业造成巨大经济损失。目前抗生素仍是最主要的治疗手段，但长期使用产生的耐药性，给疾病治疗造成很大困难。如王旭等报道，在四川地区仔猪黄痢病例中分离到的大肠杆菌，其对头孢呋辛、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢唑林、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明、呋喃唑酮、卡那霉素、庆大霉素、哌拉西林、羧苄西林、丁胺卡那霉素、氯霉素、米诺环素等19种药物敏感；对多西环素、克林霉素、多粘菌素、新霉素中度敏感；对青霉素、氨苄西林、苯唑西林、红霉素、麦迪霉素、四环素、万古霉素耐药。李沛丽等报道，贵州地区11个规模猪场中，大肠杆菌对庆大霉素、大观霉素、四环素敏感；对氨苄西林、氟苯尼考、磺胺异恶唑、复方新诺明、恩诺沙星、氧氟沙星、多西环素、金霉素中度敏感；对奥格门丁、头孢他啶、头孢噻呋、亚胺培南、粘菌素耐药。黄显晔等对黑龙江某猪场仔猪腹泻病例研究发现，分离到的大肠杆菌对头孢噻呋、头孢曲松敏感；对恩诺沙星、环丙沙星及四环素耐药。于新友等对山东滨州地区仔猪腹泻病例研究发现，分离到的大肠杆菌对头孢噻呋、恩诺沙星、复方新诺明和阿莫西林高度敏感；对青霉素G、氟苯尼考、四环素、红霉素、庆大霉素、阿米卡星表现出不同程度的耐药。丁建华等对安徽、江苏、山东、河北、广西等地分离到的大肠杆菌进行研究发现，94.4%的分离株耐受至少3种以上抗菌药物，对青霉素、多西环素、复方新诺明、甲氧苄氨嘧啶、阿莫西林、氨苄西林、四环素、头孢氨苄、卡那霉素、氟苯尼考、链霉素、头孢曲松的耐药率均在70%以上；对多粘菌素B和多粘菌素E较为敏感。孙起荣的报答，安徽地区猪源大肠杆菌对青霉素、甲氧苄氨嘧啶、复方新诺明、氟苯尼考、氨苄西林、阿莫西林高度耐药。谷振等报道，豫西地区猪源大肠杆菌对硫酸粘菌素、阿米卡星、恩诺沙星高度敏感；对头孢噻呋中度敏感。孙伟等报道，铜仁地区猪源大肠杆菌对四环素、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶、庆大霉素耐药性较高。刘雪松等报道，齐齐哈尔周边仔猪腹泻大肠杆菌对头孢曲松、环丙沙星及阿奇霉素敏感性较强。

与文献报道数据比较，本次在沈阳地区猪腹泻病例中分离到的大肠杆菌对磺胺类药物耐药性最高，对头孢菌素类药物相对较为敏感。可能与地区差异、用药习惯、药物选择差异等因素有关，建议该饲养场根据病原鉴定及药物敏感性试验结果制定针对性治疗方案。