张 博，张浩

（佳木斯大学附属第一医院整形外科，黑龙江 佳木斯 154007）

烧伤（burn）是导致皮肤损伤的主要原因之一，根据世界卫生组织统计[1]，全世界每年有近30 万人死于烧伤。在严重烧伤过程中，细胞和血管均受到损伤，分子代谢出现异常调控，进一步导致各种非编码RNA 和细胞因子等分子调控出现紊乱[2-5]。有研究表明[6-8]，微小RNA（microRNA）参与了皮肤烧伤后的分子调控代谢过程，其中microRNA-744 在皮肤烧伤具有重要调控作用。蛋白激酶cAMP 激活催化亚基α（PRKACA）是参与细胞信号转导的重要分子之一[7，8]。成纤维细胞生长因子（FGF）是组织稳态和癌症中的关键有丝分裂原，FGF2 在皮肤烧伤愈后的分子机制中也具有重要作用[9]。本研究主要探讨microRNA-744 调控PRKACA 和FGF2 对皮肤烧伤愈后疤痕形成的影响和分子间的相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和动物 30 只健康新西兰大白兔由腾新生物技术有限公司提供（许可证号：SCX2021-0004），体重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清洁级动物室适应性饲养1 周，在制备烧伤动物模型前24 h 禁食不禁水，实验方案获佳木斯大学附属第一医院伦理委员会审批通过。microRNA 提取分离试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；qRT-PCR 检测试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；microRNA 检测引物U6（北京天根生化科技有限公司）；microRNA检测引物miR-744（天根生化科技有限公司）；RNase-Free 双蒸水（北京天根生化科技有限公司）等。

1.2 实验仪器 实时荧光定量PCR（美国应用生物系统公司）、琼脂糖凝胶电泳仪(美国Bio-Rad 公司)、反转录PCR（美国应用生物系统公司）、-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Scientific 公司）、蛋白凝胶成像仪（美国Wealtec 公司）、超净工作台（山东新华医疗器械股份有限公司）、4 ℃低温高速离心机（德国Eppendorf 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 烧伤模型和组织样本收集 提前24 h 由耳缘静脉注射戊巴比妥钠，麻醉后行颈内静脉和颈动脉穿刺置管备用，将兔背部涂抹10%硫代钠脱毛，烧伤面积为总体表面积的30%。体表面积公式：A（m2）=R×W2/3，A 为体表面积（m2），W 为体重（kg），经计算烧伤面积约为514 cm2。根据烧伤时间和常用烧伤动物模型制作方法进行分组，分别为对照组、烧伤组、愈后组，每组10 例。组织样本离体后迅速冷冻至液氮中，直至MicroRNA 提取。

1.3.2 血液样本收集 用不含抗凝剂的试管釆集外周静脉血0.5 ml，室温下3000 r/min 离心15 min，去除血细胞，收集上层血清，然后将收集血清在4 ℃，3000 r/min 离心15 min，进一步除去残留血细胞；小心吸取上层血清至新的离心管，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 qRT-PCR 检测MicroRNA-744 表达 首先进行样本microRNA 提取分离，合成microRNA cDNA第一链，再进行琼脂糖凝胶电泳检测cDNA（图1），然后再进行反转录实验，反转录程序包括：①RNA加尾反应和反转录反应42 ℃，60 min；②酶失活反应95 ℃，3 min。microRNA 荧光定量检测：按实验样本数量计算各试剂总量，分装到反应管中，然后加入引物和microRNA cDNA，再加入样本的cDNA，混匀，离心，设置反应程序，进行检测，然后观察结果。样本microRNA 使用核酸定量仪测定RNA 浓度和纯度，光密度A260/A280 均在1.8～2.0 间表明RNA无降解。microRNA 经逆转录生成cDNA 后，进行琼脂糖凝胶电泳。运用qRT-PCR 检测各组样本时，如果溶解曲线分析未见杂峰，扩增产物单一，表明没有非特异性扩增。用U6 为内参，反应结束后计算Ct值。根据扩增曲线得到microRNA-744 和U6的Ct值，通过公式计算ΔCt（ΔCt=CtmicroRNA-744-CtU6），运用2-ΔΔCt法对各组样本microRNA的表达水平。

图1 cDNA 琼脂糖凝胶电泳图

1.3.4 ELISA 实验检测PRKACA 和FGF2 每孔加入100 μl 标准品、空白样品或样品；弃掉每个孔的液体，然后不要洗，向每孔加入100 μl 检测试剂A 工作溶液；用微量加样枪吸出每个孔并洗涤，重复3次，总共洗涤3 次；每孔加入100 μl Detection Reagent B 作溶液，盖上一个新的密封板，在37 ℃孵育1 h；重复抽吸/洗涤5 次；每孔加入90 μl 底物溶液，盖上新的Plate 密封剂，在37 ℃下孵育15～30 min，避光；每孔加入50 μl 终止液，如果颜色变化不均匀，轻轻敲打板确保充分混合；确定每个孔的光密度到450 nm，使用酶标仪一次测定；根据酶标仪的标准曲线进行数据分析。

1.3.5 Western Blot 检测组织PRKACA 和FGF2 蛋白表达 组织加入裂解液，4 ℃裂解1 h 后，12 000 g，4 ℃离心30 min，取上清，放于-80 ℃冰箱中，每次电泳之前进行蛋白测定，使用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，然后进行一抗、二抗反应，最后再进行显色反应和凝胶图象分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据处理，计量资料使用（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，相关性采用Pearson 线性相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组microRNA-744 表达比较 烧伤组和愈后组microRNA-744表达量分别为（6.901±1.031）、（7.583±1.067），均高于对照组的（4.671±1.012），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 各组PRKACA 和FGF2 表达量比较 烧伤组和愈后组PRKACA 表达水平低于对照组，且愈后组低于烧伤组，差异有统计学意义（P＜0.05）；烧伤组和愈后组FGF2 表达水平高于对照组，且愈后组高于烧伤组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组PRKACA 和FGF2 表达量比较（±s，ng/ml）

表1 各组PRKACA 和FGF2 表达量比较（±s，ng/ml）

2.3 各组PRKACA 和FGF2 蛋白表达量比较 烧伤组和愈后组PRKACA 蛋白表达低于对照组，且愈后组低于烧伤组，差异有统计学意义（P＜0.05）；烧伤组和愈后组FGF2 蛋白表达高于对照组，且愈后组高于烧伤组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2、图3、表2。

图2 各组PRKACA 蛋白表达量比较（表达量范围0.5～1.3）

图3 各组FGF2 蛋白表达量比较（表达量范围0.4～1.2）

表2 各组PRKACA 和FGF2 蛋白表达量比较（±s）

表2 各组PRKACA 和FGF2 蛋白表达量比较（±s）

2.4 MicroRNA -744 和 PRKACA、FGF2的关系Pearson 相关性分析显示，microRNA-744 和PRKACA 呈负相关（r=-0.821，P＜0.05），与FGF2 呈正相关（r=0.773，P＜0.05）。

3 讨论

MicroRNA 是参与基因转录后调控非常重要的非编码RNA，且其可间接影响相关蛋白质表达[10]。目前，已经有很多研究表明[11]，microRNA 与烧伤的分子调控机制密切相关，大多数microRNA 有抑制相关蛋白质表达的作用，但是microRNA-744 在皮肤烧伤愈后瘢痕形成中的具体分子机制仍尚未明确。

FGF2 是一种多功能蛋白，在伤口愈合、组织修复和再生中具有重要作用。这种治疗性蛋白质广泛用于烧伤治疗，因为其可刺激细胞增殖和分化、血管生成和细胞外基质重塑[12]。本研究结果发现，烧伤组和愈后组microRNA-744 表达量高于对照组（P＜0.05）；烧伤组和愈后组PRKACA 表达水平及蛋白表达低于对照组，且愈后组低于烧伤组（P＜0.05）；烧伤组和愈后组FGF2 表达水平及蛋白表达高于对照组，且愈后组高于烧伤组（P＜0.05）；Pearson 相关性分析显示，microRNA-744 和PRKACA 呈负相关（P＜0.05），与FGF2 呈正相关（P＜0.05），提示microRNA-744 表达可以通过抑制PRKACA 间接促进FGF2的表达，且在烧伤及愈后的发生发展中，microRNA-744的先降低和再升高导致PRKACA、FGF2 表达量发生改变，因此在烧伤及愈后发生发展中，microRNA-744 可以调控PRKACA、FGF2 表达，进而可以作为预测烧伤轻重程度及愈后发展的分子指标。

综上所述，microRNA-744 通过影响PRKACA和FGF2 含量变化，从而从分子水平实现影响调控烧伤及愈后发生发展的作用。