孙衍，渠海，宋祺，申一凡，王俪娟，牛晓红

（长治医学院附属和济医院内分泌科1，普通外科2，山西 长治 046011）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种以持续性蛋白尿和进行性肾功能下降为特征的临床综合征[1]。据报道[2]，DN 发生在糖尿病患者中的机率占20%～50%，并且是发生终末期肾脏疾病的常见原因。此外，DN 通常与动脉高血压和心血管疾病发病率和死亡率的增加有关，严重影响患者的生命安全及预后[3，4]。因此，探究治疗DN的措施及手段显得尤为重要。微小RNA（miRNA，miR）是一类非编码的单链小分子RNA[5]。最近，越来越多的证据表明miRNA 与DN的发生和发展密切相关[6，7]。在高糖（high glucose，HG）处理的肾小球系膜细胞中，过表达miR-141 可促进细胞凋亡并加剧炎症[8]。因此，miRNA 可能成为DN的诊断性生物标志物和治疗靶标。最近的一项研究表明，与2 型糖尿病相比，DN 患者中miR-320c的表达升高，这表明miR-320c的过表达可能对DN有害，但其潜在机制尚不清楚[9]。此外，另一项研究表明抑制miR-320c 可通过靶向KIF14 促进nephrin及podocin 表达，抑制HG 诱导的足细胞损伤[10]。基于以上研究结果，本研究以肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，探索miR-320c 在HG 诱导的HK-2 细胞中的表达及其对DN 作用的可能分子机制，旨在为DN 诊断及靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人肾小管上皮细胞HK-2 购自武汉普诺赛生物生命科技公司；葡萄糖购自美国sigma公司；DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司；胰蛋白酶、Lipofectamine2000 购自美国Thermo Fisher 公司；miR-320c inhibitor 及inhibitor NC 由广州锐博生物科技公司合成；兔抗人的转化生长因子β1 TGF-β1、p-Smad2/3 抗体购自美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自上海艾博抗公司；Trizol、逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒购自日本TaKaRa 公司；Ace－QqPCR SYBR Green Mix，高敏型ECL 化学发光检测试剂盒及RIPA 裂解液均购自南京诺唯赞生物公司；6 孔及24 孔细胞板购自美国Bio-Rad 公司；Transwell cell（孔径8.0 μm）购自美国Corning 公司；Matrigel 胶购自美国BD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与分组 HK-2 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 完全培养基中，并置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱培养。取生长至对数期的HK-2细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，按照1×104个/ml，100 μl 每孔的密度接种于6 孔板，正常对照组（control组）：用含有5.5 mmol/L 葡萄糖的培养基培养24 h；高糖组（HG组）：用含有45 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h；HG+inhibitor NC 组：将inhibitor NC 转染至HK-2 细胞，并用含有45 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h；HG+miR-320c inhibitor组：将miR-320c inhibitor 转染至HK-2 细胞，并用含有45 mmol/L 葡萄糖的培养基培养24 h。转染严格按照Lipofectamine 2000 试剂说明书进行操作。

1.2.2 qRT-PCR 实验 取对数生长期的各组细胞，采用Trizol 法裂解细胞，RNA 抽提试剂盒提取细胞的总RNA。立即用逆转录试剂盒合成cDNA，qRTPCR 试剂盒进行miR-320c的检测。反应体系：cDNA 模板（50 ng/μl）1.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μl，SYBR Green Mix 6 μl，单蒸水1.3 μl，共10 μl。反应条件：95 ℃，3 min 30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共40 个循环。以U6 为内参，2-ΔΔCt法计算定量miR-320c 表达水平。实验重复3 次。

1.2.3 细胞形态观察 高糖诱导24 h 后，收集4 组HK-2 细胞，制备细胞涂片，在普通光学显微镜下观察4 组HK-2 细胞的形态并拍照。

1.2.4 Transwell 侵袭实验 将Matrigel 和4 ℃预冷无血清培养基以1∶8的比例稀释后，包被在Transwell小室底部聚碳酸酯膜的上室面，将Transwell 小室放入24 孔板中，置于37 ℃培养箱中待Matrigel 凝固。将HK-2 细胞密度调至1×105个/ml，按每室200 μl接种于Transwell 小室上室中，24 孔板加入500 μl含10% FBS的DMEM 培养液培养12 h 待细胞贴壁，按前述分组及处理法处理细胞，在24 孔板中培养24 h 后，取出Transwell 小室，擦去Matrigel 胶和小室内的细胞，用预冷的4%多聚甲醛固定小室外底面的细胞30 min，0.1%结晶紫染色15～20 min，在显微镜下随机选取6 个视野计算穿膜细胞个数，实验重复3 次，取平均值。

1.2.5 细胞划痕实验 取各组处于对数生长期的HK-2 细胞，用含10% FBS的DMEM 培养基调整细胞密度至2×105个/ml，并按2 ml/孔接种于6 孔板，培养至细胞贴壁，并使融合率达90%，用200 μl 移液枪头在6 孔板内划线，用显微镜分别在0、24 h 对细胞愈合状态观察拍照，并用Image J 软件测量各组细胞划痕愈合面积，实验重复3 次，计算平均值。细胞迁移率（%）=[（0 h 划痕距离-24 h 划痕距离）/0 h 面积]×100%

1.2.6 Western blot 实验 收集前述各组细胞，用RIPA裂解液进行裂解。用BCA 法测定其蛋白浓度，裂解液在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。然后，在室温下用5%的脱脂牛奶封闭1 h，配置TGF-β1 和p-Smad2/3 蛋白一抗，4 ℃孵育过夜。用PBST 洗膜后用二抗室温孵育2 h。高敏型ECL 化学发光检测试剂盒对蛋白条带进行显色，并使用Image J 软件分析各蛋白条带灰度值，定量蛋白表达。

1.3 统计学分析 应用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，GraphPad Prism 9 软件作图，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义，P＜0.01 表示统计学意义显著，P＜0.001 表示统计学意义极显著。

2 结果

2.1 高糖诱导对HK-2 细胞中miR-320c 表达的影响 采用qRT-PCR 法检测miR-320c 在HG 处理的HK-2 细胞中的表达特征。结果显示，与control 组比较，HG 组中miR-320c 水平明显升高（P＜0.001）。此外，与HG+inhibitor NC 组比较，HG+miR-320c inhibitor 组中miR-320c的表达显著降低（P＜0.01），见表1、图1。

图1 高糖诱导对HK-2 细胞中miR-320c 表达的影响

表1 高糖诱导对HK-2 细胞中miR-320c 表达的影响（n=3，±s）

表1 高糖诱导对HK-2 细胞中miR-320c 表达的影响（n=3，±s）

注：与control 组比较，***P＜0.001；与HG+inhibitor NC 组比较，##P＜0.01

2.2 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞形态变化的影响 control 组中，HK-2 细胞呈鹅卵石样立方体形状，排列紧密，为典型的上皮细胞形态；经HG 处理后，HK-2 细胞变长，与邻近细胞解离，失去鹅卵石样形态，呈现纺锤形；而与HG+inhibitor NC组比较，HG+miR-320c inhibitor 组中纺锤形细胞数量较少。结果表明，抑制miR-320c的表达可使HG诱导的HK-2 细胞形态回归正常，见图2。

图2 抑制miR-320c 对高糖诱导HK-2 细胞形态变化的影响

2.3 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞侵袭能力的影响 与control 组比较，HG 处理HK-2 细胞后，细胞侵袭能力明显增强，侵袭细胞数明显增多（P＜0.001）；而与HG+inhibitor NC 组比较，HG+miR-320c inhibitor 组中细胞侵袭能力显著降低，侵袭细胞数也明显减少（P＜0.05），见图3、表2。

表2 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞侵袭能力的影响（n=6，±s）

表2 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞侵袭能力的影响（n=6，±s）

注：与control 组比较，***P＜0.001；与HG+inhibitor NC 组比较，#P＜0.05

图3 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞侵袭能力的影响（×200）

2.4 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞迁移能力的影响 与control 组比较，HG 处理HK-2 细胞24 h 后，细胞的迁移能力显著增强，迁移率明显提高（P＜0.001）；而与HG+inhibitor NC 组比较，HG+miR-320c inhibitor 组中细胞迁移能力显著降低，迁移率也明显降低（P＜0.001），见图4、表3。

表3 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞迁移能力的影响（±s，n=6）

表3 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞迁移能力的影响（±s，n=6）

注：与control 组比较，***P＜0.001；与HG+inhibitor NC 组比较，###P＜0.05

图4 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞迁移能力的影响（×200）

2.5 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞TGFβ/Smad 通路的影响 与control 组比较，HG 处理HK-2 细胞后，TGF-β1 及p-Smad2/3的表达显著增强（P＜0.001）；而与HG+inhibitor NC 组比较，HG+miR-320c inhibitor 组中TGF-β1（P＜0.05）及p-Smad2/3（P＜0.01）的表达显著降低，见表4、图5。

表4 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞TGF-β/Smad 通路的影响（n=3，±s）

表4 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞TGF-β/Smad 通路的影响（n=3，±s）

注：与control 组比较，***P＜0.001；与HG+inhibitor NC 组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

图5 抑制miR-320c 对高糖诱导的HK-2 细胞TGF-β/Smad 通路的影响

3 讨论

目前，miRNA 作为基因表达关键调控因子，在各种疾病发生发展中具有重要影响[11]。据报道[12]，miRNA的失衡与DN的发展密切相关。miR-21 inhibitor 可以抑制DN 中（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）及肾脏纤维化，同时改善肾脏的结构和功能[13，14]。MiR-34a-5p 在HG 诱导的HK-2细胞中上调，其过表达可能通过靶向SIRT1 加重肾小管间质纤维化[15]。研究显示[16，17]，miR-320c 在DN患者中明显上调，表明miR-320c 可以作为治疗DN的候选靶标。此外，抑制miR-320c 可通过靶向KIF14 促进nephrin 及podocin 表达，抑制HG 诱导的足细胞损伤。本研究旨在阐明miR-320c 在DN 中的调控作用及其分子机制，实验结果显示在HG 诱导的HK-2 细胞中，miR-320c的水平明显高于正常HK-2 细胞，之后还合成了miR-320c inhibitor以探索其功能。细胞形态结果显示，抑制miR-320c下调miR-320c 表达水平，可以保留HK-2 细胞正常的鹅卵石立方体形状，这表明miR-320c 可能对DN 有害。

EMT 被认为是肾小管间质纤维化发生发展的起始因素之一[18]。目前，EMT的发生已经在各种形式的慢性肾脏疾病中得到了证实，包括DN[19]。尽管肾小管间质纤维化也可能在这些疾病早期阶段出现，但物质的积聚往往伴随着疾病进展，与肾功能逐渐下降有关[20]。因此，进行性肾小管间质纤维化通常是导致DN 肾衰竭的常见途径。上皮细胞通过EMT 从上皮间室转移到间质，获得完整的间质表型，其特征是上皮细胞间黏附性钙粘蛋白表达减少，α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白表达增加[11，21]。这种向间充质状态的转变促进了细胞运动并形成了新的膜突起。最后，增加的细胞突起和金属蛋白酶的表达导致额外的细胞基质降解，细胞迁移和侵袭行为[22，23]。即EMT的发展伴随着细胞迁移和侵袭能力的增强[24]。在本研究中，Transwell 侵袭试验和细胞划痕实验表明，用HG 处理的HK-2 细胞中侵袭细胞的数目和迁移率显着增加，但是抑制miR-320c 可以显著降低这些细胞的侵袭性和迁移能力。这些数据进一步说明了miR-320c inhibitor 可以抑制HG 诱导的HK-2 细胞的侵袭性和迁移能力，从而可能发挥EMT 抑制作用。

TGF-β1 是DN的关键中介因子[25]。TGF-β1 通过与TGF-β 受体Ⅱ（TβRⅡ）结合启动其细胞内信号转导，激活TGF-β 受体Ⅰ（TβRⅠ）激酶，导致受体调控的Smads 磷酸化，称为Smad2 和Smad3[26，27]。在DN 患者及1 型DN的实验动物模型中，通过肾小球和小管间质细胞中磷酸化的Smad2 和Smad3的核易位，TGF-β/Smad 信号被高度激活，TGF-β/Smad 信号的激活显著促进了肾小球和小管间质纤维化[28，29]。在体外，高糖环境、年龄和血管紧张素Ⅱ可以激活Smad2 和Smad3，诱导系膜细胞、小管上皮细胞和血管平滑肌细胞合成胶原基质[30]。因此，TGF-β/Smad 信号通路在DN 中是过度激活且有害的。目前，有一些报道揭露了TGF-β/Smad 信号通路在DN 中的作用。比如，抑制miR-135a-5p 可通过靶向SIRT1 改善DN 中诱导的肾纤维化[31]；miR-346通过TGF-β/Smad 信号通路调控DN 相关基因表达,在DN的发生和发展中起到非常重要的作用[32]；芪地糖肾颗粒通过TGF-β1-Smad2/3 通路下调TGF-β1的表达水平从而对DN的纤维化产生治疗作用[33]。在本研究中，结果发现HG 处理HK-2细胞后，TGF-β/Smad 信号通路被高度激活，而加入miR-320c inhibitor 可抑制HG 诱导下HK-2 细胞TGF-β/Smad 通路的激活，表明抑制miR-320c的表达可通过抑制TGF-β/Smad 信号通路对DN产生治疗作用。

综上所述，本研究证明了与正常HK-2 细胞相比，HG 处理的HK-2 细胞中miR-320c 显著上调。此外，抑制miR-320c的表达可以抑制HG 诱导的HK-2 细胞的侵袭和迁移，从而可能对EMT的发生起作用。最后，miR-320c 抑制剂对TGF-β/Smad 信号通路的表达具有负调控作用。