胡嘉莉，华琳

（首都医科大学生物医学工程学院，北京 100069）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常见的癌症之一，也是西方男性癌症死亡的第2 大原因。有资料显示[1]，我国70 岁以上人群前列腺癌的发生率高达25%。早期前列腺癌不易被发现，大多数前列腺癌患者初诊时已经发生癌细胞转移，失去治愈的机会。在过去的几十年中，虽然前列腺癌的诊断技术已经得到了显著提高，而且前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）也被认为有助于提高前列腺癌的诊断率，但当前也有很多研究认为应用PSA 诊断前列腺癌并不完全成功。有研究表明，相比PSA，碱性磷酸酶（ALP）在评估治疗反应上的准确性更高[2]。miRNA（microRNA）是由18～25 个核苷酸组成的非编码RNA，参与基因表达的转录后调控[3]。研究认为[4]，体液中miRNA 表达差异与前列腺癌患者的预后相关，可能成为评估前列腺癌患者预后的分子标记物。本文通过对前列腺癌的mRNA 和miRNA的双重表达谱的生物信息学分析，探讨miRNA 和mRNA 在前列腺癌中的分子调控机制并构建调控网络，报道如下。

1 资料与方法

1.1 前列腺癌的miRNA 表达谱数据及差异表达分析通过GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取前列腺癌的miRNA 表达谱数据，数据平台为GSE8126，该数据中包括60 个前列腺癌组织样本和15 个正常前列腺组织样本。通过对数据的预处理（中心化，对数变换和标准化），获得326 个miRNA的表达值。采用matlab 生物信息工具箱中的t检验筛选差异表达的miRNA，定义差异表达的miRNA为：P＜0.05 且FDR＜0.01，其中Fold_change＞1.5 认为该miRNA 是上调的，Fold_change ＜1/1.5 认为该miRNA 是下调的。

1.2 前列腺癌的mRNA 表达谱数据及差异表达分析通过GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获取前列腺癌的mRNA 表达谱数据，数据平台为GSE6956，该数据中包括60 个前列腺癌组织样本和15 个正常前列腺组织样本。通过对数据的预处理（中心化，对数变换和标准化），获得13 787 个mRNA的表达值。差异表达mRNA的筛选标准为P＜0.05且FDR＜0.01；其中Fold_change＞1.5 认为该mRNA是上调的，Fold_change＜1/1.5 认为该mRNA 是下调的。

1.3 miRNA 和mRNA的调控关系

1.3.1 基于Pearson 相关的miRNA-mRNA 反向调控从MicroCosm Targets 数据库（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/）下载筛选出的 Fold_change 最大的上调的 miRNA 和Fold_change 最小的下调的miRNA的靶基因，计算它们与靶基因的Person 相关系数并分析这两个miRNA 和它们的靶基因的反向调控关系。

1.3.2 基于广义典则相关分析的miRNA-mRNA 调控 采用改进的广义典则相关分析筛选出所有上调和下调的miRNA 和mRNA，探讨miRNA 和mRNA的调控关系并构建调控网络。提取前10 个miRNA和前20 个mRNA 作为前列腺癌的特征生物标记，采用R 软件的mixOmics 软件包（http://r-project.org）进行分析。

1.3.3 miRNA-mRNA 网络构建 基于广义典则相关分析，确定典则相关系数的cutoff 值并根据cutoff值，保留获得的miRNA-mRNA 调控关系，根据该调控关系构建相应的调控网络。网络中的miRNA 如果调控的mRNA的数目较多，称为该miRNA 具有较高的度，为网络中的hub miRNA，认为其是与前列腺癌相关的重要生物标记。

2 结果

2.1 miRNA 表达谱数据的差异表达分析 共发现117 个差异表达的miRNA，其中有15 个差异表达的miRNA 是下调的，如miR-521 和miR-527 等；有20个差异表达的miRNA 是上调的，如miR-511 和miR-526a 等。将上调和下调的差异表达的miRNA进行双向层次聚类，见图1。

图1 上调和下调的差异表达的miRNA

2.2 mRNA 表达谱数据的差异表达分析 共识别出9054 个差异表达的mRNA，其中有35 个差异表达的mRNA 是下调的，有36 个差异表达的mRNA 是上调的。双向层次聚类结果见图2，mRNA 表达谱能够很好的区分不同组织起源的样本。

图2 上调和下调的差异表达的mRNA

2.3 miRNA 和mRNA的调控关系

2.3.1 基于Pearson 相关的miRNA-mRNA 反向调控Fold_change 最小的下调miRNA 为miR-137，在MicroCosm Targets 数据库中发现了其对应的1991个靶向基因，其中上调的基因为HOXC4、NPIPL3 和WSB1。miR-137 和HOXC4的相关系数为r=-0.5566，P=2.15E-07；miR-137 和NPIPL3的相关系数为r=-0.7366，P=4.98E-04；miR-137 和WSB1的相关系数为r=-0.7959，P=1.44E-17；miR-137 和这3 个基因呈反向调控关系。Fold_change 最大的上调miRNA为miR-367，在MicroCosm Targets 数据库中发现其对应的2045 个靶向基因，其中下调的基因分别为MEFA 和TNFAIP6。miR-367 和MEFA的相关系数为r=-0.7840，P=8.99E-17，miR-367 和TNFAIP6的相关系数为r=-0.7627，P=1.85E-15；miR-367 和MEFA 及TNFAIP6 呈反向调控关系。

2.3.2 基于广义典则相关的miRNA-mRNA 调控 对于提取出的全部差异表达的上调和下调的miRNAmRNA 双重表达谱数据集采用改进的广义典则相关分析，结果显示，该法可以有效区分前列腺癌样本和正常人群样本，见图3。根据第一主成分的权系数，提取出与前列腺癌相关度最高的前10 个miRNA 和前20 个mRNA，见图4A、图4B。在这些提取的miRNA 和mRNA 中，有些miRNA 和mRNA 被已有报道证实是与前列腺癌相关的，如发现MED13L的第一主成分权系数在前列腺癌患者中最高。有研究发现MED 家族的基因，如MED12的体细胞突变会导致前列腺癌的发生[5]。对于miRNA，其中miR-29b和miR-29b-1*的第一主成分权系数在正常人群中最高。此外，miR-488*的第一主成分权系数在前列腺癌患者中最高。按照典则相关系数的cutoff 为0.9的标准，保留了所有典则相关系数大于0.9的miRNA-mRNA 调控关系，绘制miRNA 和mRNA的调控网络图，其中miR-29b 和miR-29b-1*是网络中度最高的两个结点（度=21），这两个miRNAs 在网络中调控的基因数最多，见图5。

图3 基于广义典则相关分析的样本分类

图4 基于第一主成分权系数提取的前列腺癌相关度最高的生物标记

图5 前列腺癌相关的miRNA-mRNA 分子调控网络

3 讨论

前列腺癌是男性生殖系最常见的恶性肿瘤，研究表明分子调控机制在前列腺癌的预后和诊断中有着非常重要的作用。本研究对前列腺癌的mRNA 和miRNA的双重表达谱进行了生物信息学分析，采用了差异表达分析提取了与前列腺癌相关的上调和下调的miRNA 和mRNA，并通过Pearson 相关分析和广义典则相关分析探讨了miRNA 和mRNA的分子调控机制。广义典则相关分析可用于特征降维，特征融合和相关分析等。将广义典则相关分析应用于特征miRNA 和mRNA的提取，其中特别结合了miRNA 和mRNA的靶向失调关系作为预设矩阵，并根据miRNA 或mRNA 在第一个成分的权系数提取与前列腺癌相关的特征miRNA 和特征mRNA。

本研究发现，MED 家族基因MED13L的第一主成分权系数在前列腺癌患者中最高。有研究发现，在局限性前列腺癌患者的异质性肿瘤病灶中检测到体细胞肿瘤变异，发现cfDNA 突变负荷与疾病严重程度相关。在cfDNA 中发现了体细胞组织的改变，其中就包括MED 家族中MED12的非同义变异[6]。此外，TRRAP 是本次识别的与前列腺癌高度相关的基因。TRRAP 曾在阴茎鳞状细胞癌[7]和卵巢癌中检测到突变[8]。在通过外显子测序及Sanger 测序探索66 个家族中140 例患有前列腺癌的日本患者的生殖系变异研究中，除了已知的易感基因BRCA2 和HOXB13 外，还发现了TRRAP 变体以及BRCA2、HOXB13 和TRRAP的共同变体[9]。

了解癌症中miRNA的调控机制对于理解其生理作用以及癌症相关功能障碍和失调的影响至关重要[10]。近年来的研究表明，miRNAs的异常表达与前列腺癌的发生、侵袭、转移及预后密切相关。虽然已经报道了许多miRNAs 可作为前列腺癌治疗的新生物标记物，但报告的数据不一致，仍需进一步实验[11]。因此，研究前列腺癌相关的miRNA 及其调控的靶向基因对于识别前列腺癌相关的生物标记及这些生物标记在前列腺癌的临床应用有着十分重要的价值。

本研究发现，miR-29b 与前列腺癌高度关联，并在miRNA-mRNA 分子调控网络中调控的基因数最多。目前，已有文献证实miR-29b 可以阻止前列腺癌的发生和发展。Zhu C等[12]发现前列腺癌患者肿瘤组织中miR-29b的表达明显低于癌旁组织，有望成为前列腺癌诊断的新生物标志物。Ivanovic RF等[13]研究认为，恢复miR-29b 水平的治疗可能是控制前列腺癌转移的有效方案。Sur S等[14]在瘤内注射模拟miR-29b，显著抑制了裸鼠前列腺癌异种移植瘤的生长，表明miR-29b 可以作为前列腺癌治疗的潜在分子，为未来开发前列腺癌的药物靶向提供帮助。Vladimir AV等[15]在年轻男性前列腺癌患者的分子特征研究中发现，miR-29b的表达与老年男性前列腺癌患者显著不同，这项研究为前列腺癌亚型的分子机制提供了参考。Kato M等[16]的研究表明，miR-29b 与其他五种miRNA 协同调节促进转移的基因（LOXL2），揭示了前列腺癌发病机制的新分子机制。此外，miR-488 是本研究中发现的与前列腺癌相关度最高的前10 个miRNA。miR-488 在多种肿瘤中作为抑癌基因发挥作用，如乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌等[17-19]。Wang J等[20]研究发现，miR-488 在前列腺癌患者肿瘤组织中的表达低于正常组织，其通过靶向PFKFB3 可以抑制前列腺癌细胞的增殖和糖酵解，因此可能会作为潜在的前列腺癌新的治疗靶点。本研究也存在一定的局限性。如数据库中的前列腺癌相关的miRNA-mRNA 双重表达谱数据集相对很少，因此不能保证分析结果的稳定性；此外，本研究结果是基于miRNA-mRNA 双重表达谱数据的生物信息学分析，识别出的特征miRNA 和mRNA 还需要应用分子生物实验进行验证。

综上所述，MED 家族基因MED13L的第一主成分权系数在前列腺癌患者中最高，TRRAP 是与前列腺癌高度相关的基因；miR-29b 与前列腺癌高度关联，并在miRNA-mRNA 分子调控网络中调控的基因数最多，而miR-488 是与前列腺癌相关度最高的前10 个miRNA。