袁晓霞，肖 杨，罗瑶敏，魏 晨，蒋振

（川北医学院基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，四川 南充 637000）

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）为长度超过200 个nt的RNA 分子，其本身不编码蛋白，但在多种疾病的发生发展过程中发挥着调控作用[1-3]。研究表明[4-7]，lncRNA 与肿瘤的发生发展、侵袭转移、耐药及预后密切相关。癌症易感候选基因9（cancer susceptibility candidate 9，CASC9）作为lncRNAs 家族的一员，被首次发现是在食管癌中的致癌作用，近年来被证实与越来越多的人类恶性肿瘤相关，其中大多数来源于鳞状上皮组织[8，9]。但目前对于长链非编码RNA CASC9的研究多为针对单独的靶点进行细胞内的实验研究，很少涉及对长链非编码RNA CASC9 在细胞内功能的整体研究，这使得对长链非编码RNA CASC9的功能至今还不明确。为了全面阐明长链非编码RNA CASC9在细胞内的调控分子功能及生物学过程，本研究运用生物信息学分析方法，分析CASC9 在细胞内的调控靶基因及信号通路，并对其进行生物学功能注释，探索CASC9 在细胞内的功能作用和分子机制。

1 资料与方法

1.1 lncRNA CASC9 靶基因预测 经NCBI 基因数据库查询lncRNA CASC9的序列，经miRDB 数据库（http://www.mirdb.org/）和Starbase3.0 数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）预测与CASC9 有miRNA-lncRNA 互作关系的miRNA，将miRDB 数据库预测到miRNA 与Starbase3.0 数据库预测到的miRNA 取交集进行进一步分析。

1.2 miRNAs 靶基因预测 在Starbase3.0 数据库中分别对miRNA 进行靶基因预测，选取预测程序个数为3，取预测到靶基因的评分排序前5 个，通过DAVI数据库进行靶基因的GO 注释和信号通路富集分析（Pathway）。

1.3 GO 注释 从基因功能的3 个方面：细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物学过程（biological process，BP），得到具有统计学意义的GO 注释（P＜0.05），信号通路富集分析阈值取P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNA CASC9 预测miRNA 在miRDB 数据库预测到50 个miRNA，Starbase 3.0 数据库预测到23个miRNA，取两者交集共有16 个miRNA，其中有13 个是在Starbase3.0 数据库预测程序数为3 时能预测到靶基因的miRNA，其miRNA 序列见表1。

表1 lncRNA-CASC9 预测的miRNAs

2.2 GO 注释分析 将筛选出来的13 个miRNAs，通过分析其本身的序列及其在细胞内的功能，根据其与长链非编码RNA CASC9 结合能力进行筛选，选取其中的结合能力强、评分较高的前5 个miRNA 并对其进行靶基因预测。GO 功能注释显示：长链非编码RNA CASC9 通过hsa-miR-383-5p 作用的靶基因主要调控金属离子的结合信号通路，蛋白质的泛素化降解过程；长链非编码RNA CASC9 通过hsamiR-423-5p 作用的靶基因主要调控金属离子的结合信号通路，蛋白质的磷酸化过程；通过hsa-miR-3184-5p 作用的靶基因主要调控镁离子的结合，Tau蛋白信号通路以及Wnt 信号通路；通过hsa-miR-146b-5 作用的靶基因主要调控金属离子的结合信号通路，蛋白质的磷酸化过程；通过hsa-miR-146a-5p 作用的靶基因主要调控蛋白激酶的结合信号通路以及蛋白质的磷酸化过程，见图1。

图1 GO 注释分析

图1 GO 注释分析(续)

图1 GO 注释分析(续)

2.3 信号通路富集分析 长链非编码RNA CASC9通过hsa-miR-383-5p 作用的靶基因主要调控泛素化降解及MAPK 信号通路的作用过程；通过hsamiR-423-5p 作用的信号通路主要是RAS 信号通路及雌激素受体信号通路；通过hsa-miR-3184-5p作用的靶基因主要调控MAPK 信号通路，RAS 信号通路及雌激素受体信号通路；通过hsa-miR-146b-5 作用的信号通路包括自噬及粘附信号通路；通过hsa-miR-146a-5p 作用的靶基因主要调控蛋白质的泛素化降解，p53 信号通路及细胞周期过程，见图2。

图2 富集通路分析

图2 富集通路分析（续）

3 讨论

健康细胞中的细胞增殖受到生长信号和细胞周期调节因子的严格调控，以维持细胞内环境稳定。在与各种癌症类型中细胞的不受控制的增殖相关的多种因素中，CASC9 通过不同的机制是癌细胞持续生长的必要因素。

CASC9 最先被发现是在食管癌中的致癌作用，后续研究证实越来越多的人类恶性肿瘤与CASC9相关，其中大多数来源于鳞状上皮组织。CASC9 表达在多种恶性肿瘤中异常升高，其过表达可加速细胞增殖，癌细胞的迁移、细胞生长和耐药性，同时抑制细胞凋亡[10-12]。此外，CASC9 与鳞状上皮细胞的肿瘤性转化和非鳞状上皮组织中的鳞状化生密切相关[13-15]。研究显示，在食管鳞状细胞癌（ESCC）中CASC9 异常表达，其中功能分析揭示了CASC9 在促进体外细胞增殖和体内肿瘤生长中的作用[16，17]。研究发现[18-21]，CASC9的表达与癌症进展之间存在直接相关性，与对照细胞相比，CASC9的缺失降低了癌细胞的细胞增殖和集落形成，而过表达则具有相反的作用。

本研究运用生物信息学方法分析CASC9的分子调控网络，利用miRDB、Starbase 等数据库查询与CASC9 相关的miRNAs 共16 个，再利用这些miRNA预测其作用的靶基因，进一步对其进行GO 功能注释和Pathway 信号通路富集。结果显示，与CASC9相关的miRNAs 分别是hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-5p、hsa-miR-146b-5p、hsamiR-146a-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-497-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-488-3p。进一步选取前5 个评分最高的miRNA 进行功能分析，结果发现hsa-miR-383-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-3184-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-146a-5p的靶基因主要分子功能分布在金属离子结合、镁离子结合等分子生物学功能，表明其生物学功能主要和细胞内的金属离子功能密切相关，其生物学过程主要分布在蛋白质的磷酸化和信号通路上，表明它们的生物学功能主要与蛋白质磷酸化和肿瘤信号通路相关。

在生物系统中，细胞增殖和细胞周期受到各种检查点、肿瘤抑制基因、癌基因和其他下游靶标的紧密调控。在鼻咽癌（NPC）中，CASC9 与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）相互作用，增强其稳定性并进一步促进NPC的糖酵解，从而促进细胞增殖[22]。另一方面，信号通路富集显示，它们主要分布在泛素介导的蛋白质降解通路，Autophage 相关信号通路，MAPK信号通路，RAS 信号通路以及细胞内的肿瘤信号通路，提示它们的功能主要与细胞内肿瘤相关的代谢通路和信号通路相关。在ESCC 细胞中，CASC9 通过降低相关mRNA 水平下调程序性细胞死亡4（PDCD4）蛋白。对细胞周期调节因子的研究已经确定了PDCD4 和CASC9 之间的强相关性，其中PDCD4 部分恢复了由CASC9 敲除引起的G1/S 停滞。从机制上来看，敲低CASC9 降低了S 期细胞周期蛋白E2（CCNE2）和CDK6的表达，而抑制PDCD4 恢复表达[23]。另外，在肺腺癌（LAD）中还发现CASC9的上调通过细胞周期蛋白D1 调节G1期的细胞周期进程[24]。体外试验证明[25]，CASC9的上调导致TU212 喉癌细胞中葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）基因的过度表达，从而促进细胞增殖。CASC9 调节TGFβ2 mRNA的稳定性，从而上调TGFβ 和TERT的表达水平，进而导致对Decapentaplegic 同源物3的磷酸化增加。因此，与CPSF3 和TGFβ 相关的CASC9 有助于提高CRC 细胞的增殖[26]。

综上所述，长链非编码RNA CASC9 在细胞内的调控作用与镁离子结合、蛋白质磷酸化调控、蛋白质泛素化降解、自噬以及多种肿瘤发生信号通路密切相关，其可通过上述作用通路调控疾病的病理进展。