张逢乐，杨辉

（广州市荔湾区中医医院，广东广州510000）

骨质疏松性椎体骨折被认为是老年人群面临的一个重大健康问题。骨质疏松症导致的骨折几乎占所有骨折病例的一半，对健康相关的生活质量有很大影响[1]。然而，这一估计可能低估了它们的真实患病率，考虑到只有四分之一的人得到了临床关注，要么是由于缺乏放射学关注，要么是因为缺乏公认的经典症状[2]，以及他们的诊断不足[3]。令人担忧的是，在最初的椎体骨折持续后，继发性椎体骨折的比例高得惊人。据报道，在第一次脊椎骨折后的第一年，再次获得脊椎骨折的风险高达20%[4]。相关研究表明，首次骨折后继发椎体骨折的风险高达4-7倍，随着先前椎体骨折的数量的增加呈正相关性增加[5-6]。

位于美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的校园内的GEO数据库存储了高通量测序等基因组数据，其由NCBⅠ建立和维护。近几十年来，基因组水平的基因突变筛选广泛借助微阵列技术和生物信息学分析，这有助于帮助我们识别与椎体骨折发生发展相关的差异表达基因和功能通路[7-8]。因此，本研究从GEO数据库下载骨质疏松性椎体骨折miRNA微阵列数据集，并对其进行分析，以获得骨质疏松性椎体骨折和健康人群之间的差异表达miRNA；通过GO富集、KEGG富集和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，探讨骨质疏松性椎体骨折发生和发展的分子机制。

1 材料和方法

1.1 基因芯片信息NCBⅠ-GEO被视为一个免费的基因芯片/基因图谱公共数据库，我们从中获得了健康人群和骨质疏松性椎体骨折的miRNAs表达谱GSE93883，其包括6例健康患者血浆样本（GSM2464440、GSM2464441、GSM2464442、GSM2464443、GSM2464444、GSM2464445）和6例椎体骨折患者血浆样本（GSM2464452、GSM2464453、GSM2464454、GSM2464455、GSM2464456、GSM2464457）。

1.2 miRNA-mRNA调 控 网 络 构 建TargetScan[9]、miRDB[10]两个在线数据库被应用于差异miRNA靶基因的预测，其交集的预测基因作为差异miRNA的靶基因。为了构建miRNA-mRNA调控网络图，我们借助cytoscape 3.7.0软 件[11]，miRNA和mRNA作为节点，miRNA和mRNA的相互关系为连线，类三角形代表3个差异最明显的miRNA，椭圆形代表靶基因。

1.3 PPⅠ网络构建和集簇模块分析PPⅠ网络信息通过在线工具STRⅠNG（检索相互作用基因的检索工具）进行分析[12]，筛选条件medium confidence＞0.9，然后应用Cytoscape v3.7.0软件构建差异表达基因的PPⅠ网络。Cytoscape软件是一款开源生物信息学软件，可以对分子相互作用网络可视化。集簇模块分析借助MCODE插件完成[13]。其筛选条件为：Degree CUTOFF:2，Node Score Cutoff:0.2，Max Depth:100，K-Core:2。

1.4 GO和KEGG分析 基因本体论分析（GO）是定义基因及其RNA或蛋白质产物的常用方法，以确定基因组或转录组数据的生物学特性。KEGG是一组处理生物途径、疾病、药物和化学物质的数据库集合。为了分析靶基因的作用机制，本研究使用R软件、clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包进行生物学分析和可视化。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSE93883芯片集处理利用R软件对GSE93883芯片集进行热图可视化（图1），差异表达的miRNA包 括hsa-miR-205-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-4666a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-4775、hsa-miR-4508、hsamiR-1273a、hsa-miR-1253、hsa-miR-4459、hsa-miR-1273f、hsa-miR-665、hsa-miR-4739、hsa-miR-4505、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-4522等。

图1 GSE93883富集热图

2.2 DEmiRNA-基因调控网络 对于预测的靶基因，本研究把Degree大于5作为进一步筛选的条件。通过本地软件Cytoscape对miRNA-靶基因调控网络进行可视化（图2）。

图2 miRNA-mRNA调控网络图

hsa-miR-205-5p的 靶 基 因 有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B、THBS1、TGFA、TAOK1、STON2、SORBS1、SMAD4、SMAD1、SⅠAH1、SH3GL3、SALL4、RPS6KA3、RNF4、RARA、RAP2B、RAB9B、RAB14、QKⅠ、PTPRJ、PTEN、PSMA4、PRKCE、PRKCA、PPP3R1、PLCB1、PJA2、PⅠCALM、PHC2、PAFAH1B1、NSF、NOTCH2、NECAP1、MPRⅠP、MGRN1、MGAT4A、MED13L、MED1、MDM4、LRP6、LPAR1、LAMC1、KMT2A、ⅠNSR、HERC3、H2AFJ、GCC2、GATA3、FBXO22、EZR、EREG、ERBB4、ERBB3、E2F1、DDX5、CSF1、CREB1、CNⅠH1、CLTC、CENPO、CENPF、CDK19、CDC27、CALU、AXⅠN2、ACTB、AAK1。

hsa-miR-660-5p的 靶 基 因 有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6、STX16、SMARCA5、SKP1、SGⅠP1、SEC22C、SDC1、SAA1、RHOH、RAB33B、RAB11A、PPARGC1A、NR3C1、NCOR1、MEX3C、MED8、MDM2、LAMC2、KLHL11、KⅠF3A、KBTBD8、ⅠTGA1、ⅠRS1、HⅠP1、HⅠF1A、GOSR2、GORASP1、ETS1、EPAS1、DNAJC3、CUL5、COG6、CEP63、CENPM、CD47、ASB5、APP、APLP2、ANAPC5、AGO1。

hsa-miR-155-5p的靶基因有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14、TRⅠM32、TLE4、TCF7L2、TAB2、SUFU、SPⅠ1、SOCS6、SOCS5、SOCS1、SMARCA4、SMAD2、SMAD1、SGⅠP1、SCG2、S1PR1、RPS6KB1、RPS6KA3、RNF123、RGP1、REPS2、RELA、RAP1B、RAB5C、RAB3B、QKⅠ、PTPRJ、PⅠCALM、PⅠAS1、NRG3、MAP3K7、KSR1、KRAS、KⅠF3A、HⅠF1A、HERC4、GRⅠP1、GATA3、FXR1、FOS、FBXO30、FBXO22、FBXO11、ETS1、E2F2、DYNC1Ⅰ1、DET1、DCUN1D3、CSF1R、COPS3、CNⅠH1、CKAP5、CHD9、CEBPB、CBL、BPⅠFB2、BDNF、ARRB2、APC、AGO4、ADAM10、ACⅤR1、ACTA1、AAK1。

2.3 蛋白互作网络PPⅠ本研究借助String数据库对靶基因完成蛋白互作网络分析（PPⅠ），接着利用Cytoscape3.7.0软件对蛋白网络进行可视化（图3）。该网络含有371个节点，1175条边。

图3 PPⅠ网络图

2.4 重要基因的集簇模块 通过MCODE插件对PPⅠ网络进行分析，我们得出靶基因的集簇模块（图4）。集簇模块1得分23.00，包含23个节点，253条边；集簇模块2得分9.52，包含26个节点，119条边；集簇模块3得分6.00，包含18个节点，51条边；集簇模块4得分5.89，包含19个节点，53条边（表1）。通过集簇模块得出重要的靶基因为：KLHL11、SⅠAH1、FBXO11、FBXO22、HERC4、HERC3、UBE2H、DET1、MGRN1、RNF4、CUL5、CDC27、ANAPC5、SKP1、FBXO30、KBTBD8、ASB5、PJA2、MEX3C、TRⅠM71、TRⅠM32、SOCS1、RNF123。

图4 排名前4的集簇模块

表1 集簇模块所含的靶基因

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析显示，差异表达miRNA通过靶基因作用于椎体骨折的分子机制包括以下，其中生物过程为：翻译后的蛋白质修饰、髓系细胞分化、调节造血作用、积极调节分解代谢过程、有丝分裂细胞周期相变的调控、类固醇激素反应、肌肉组织发展、细胞周期相变的调节等；细胞成分为：转录因子复杂、核染色质、有被小泡、谷氨酸的突触、运输囊泡、突触前、RNA聚合酶ⅠⅠ转录因子复合物、主轴等；分子功能为：泛素样蛋白转移酶活性、泛素蛋白转移酶活性、DNA结合转录激活因子活性、生长因子受体结合、泛素样蛋白连接酶活性、核激素受体结合、激素受体结合等；Pathway信号通路为：PⅠ3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、人类乳头瘤病毒感染、小分子核糖核酸在癌症、蛋白聚糖在癌症、人类t细胞白血病病毒1感染等（表2、表3和图5）。

图5 GO和KEGG pathway富集分析

表2 GO富集分析结果

表3 KEGG pathway富集分析结果

3 讨论

microRNA（miRNA）是转录后调节因子，可调节骨细胞中的多种细胞过程。由于最佳的miRNA靶向功能对其功能至关重要，因此miRNA（miRSNPs）或mRNA（PolymiRTS）基因座内或附近的单核苷酸多态性（SNP）可能会破坏miRNA-mRNA的相互作用，从而导致骨骼代谢改变和骨质疏松症。最近的人类使用miRNA分析进行的骨骼特征研究，全基因组关联研究和功能研究开始破译复杂的miRNA调控网络。这些研究表明，miRNA可能是有前途的骨标志物[14]。它们通过与目标mRNA（mRNA）分子碱基配对而获得生物活性，从而在3'非翻译区引导蛋白质复合物（称为RⅠSC）。RⅠSC与mRNA序列的结合会导致mRNA降解或翻译抑制[15]。本研究得出重要的miRNA分别为miR-205-5p、miR-660-5p、miR-155-5p。Roland Kocijan等通过多元分析证实miR-155-5p可作为骨质疏松症脆性骨折的miRNA生物标志物[16]。研究证明骨质疏松症样品中miR-205-5p上调，RUNX2的过表达可显着减弱miR-205-5p对成骨细胞标志物的作用，表明miR-205-5p可能通过靶向RUNX2抑制成骨细胞分化[17]。其中hsa-miR-205-5p的靶基因有YES1、YAP1、ⅤTⅠ1B、ⅤEGFA、TNRC6B等，hsa-miR-660-5p的靶基因有YWHAH、YES1、UBE2H、TRⅠM71、TRAF6等，hsa-miR-155-5p的 靶 基 因 有YWHAZ、YWHAE、XⅠAP、ⅤAⅤ3、TSPAN14等。本研究得出的miRNA-mRNA调控网络可以成为后续研究的对象，为阐明骨质疏松性椎体骨折后续更深入的研究提供依据。

GO富集分析与KEGG pathway富集分析有助于更深入地认识并识别出miRNA靶向基因的功能和机制。本研究筛选出骨质疏松性椎体骨折的重要信号通路包括PⅠ3K-Akt信号通路、Ras信号通路和MAPK信号通路等。其中PⅠ3K-Akt通路与骨质疏松性椎体骨折有着密切的联系，PⅠ3K/AKT信号的激活转导上调成骨细胞分化标记基因的表达，包括BMP-2和ALP，从而促进OB的增殖、分化[18]。OB中PⅠ3K/Akt信 号 通 路 的 特 异 性 抑 制 剂LY294002可以阻断PⅠ3K的激活，从而抑制OB增殖、钙积累、ALP活性，还能抑制OCN，Osterix和Runx2 mRNA的表达[19]。PⅠ3K/Akt信号通路通过促进OB增殖、分化和骨形成从而参与OP的抑制。Rap1是调节细胞-细胞粘附，细胞-基质粘附和肌动蛋白重排的小型GTPase，在细胞扩散和内皮屏障功能过程中保持动态协调[21]。Rap1/MAPK信号通路可促进OB增殖分化并抑制其凋亡[21]。锶可以通过激活Ras/MAPK信号通路和下游转录因子Runx2促进MSC的成骨分化[22]。成骨前细胞的ECM矿化和BMP-2诱导的多能间充质干细胞可以通过MAPK信号传导途径的微调来控制。此外，MEK-1抑制剂可用于促进骨形成，延迟骨折愈合的治疗或骨折愈合后局部骨质疏松改变的进展[23]。

miRNA对其靶基因调控的研究在miRNA研究中尤为重要。本研究最终筛选出重要的靶基因包括SKP1、CBL、ANAPC5、FBXO30、KBTBD8、ASB5、SOCS1、KLHL11、FBXO11、FBXO22。SCF泛 素 连 接 酶 由Skp1，Cdc53，Hrt1和F-box蛋 白（FBP）组成[24]。磷酸化的β-连环蛋白被Skp1/Cul1/F-box（SCF）复合物识别，并被泛素化以被蛋白酶体降解[25]。CbL是衔接蛋白和E3连接酶，在影响各种细胞功能的几种信号传导途径中起正负作用。废除Cbl-PⅠ3K相互作用可增加骨形成和成骨细胞增殖[26]。AnapC5是ⅠL-17信号通路的新型衔接子和负调节剂，AnapC5沉默增强了ⅠL-17诱导的基因表达[27]。F-box蛋白与各种生物学过程相关，例如胚胎发育，成年骨形成和肿瘤发生[28]。miR-155通过SAPK/JNK途径靶向SOCS1，从而调节TNF-α调控的成骨分化[29]。研究表明miR-433-3p是长链非编码RNA SNHG14的直接靶标，并且直接靶向仅F-box蛋 白22（FBXO22）。敲 低FBXO22和SNHG14以及miR-433-3p的过度表达均能显着抑制骨肉瘤细胞的增殖，迁移和侵袭，但诱导细胞凋亡。miR-433-3p抑制剂减弱了SNHG14抑制对骨肉瘤细胞增殖，侵袭和迁移的抑制作用。SNHG14通过充当miR-433-3p的ceRNA来调节FBXO22的表达来促进骨肉瘤的进展，表明SNHG14可能成为治疗骨肉瘤的潜在靶点[30]。

目前miRNA在骨折的研究较少[31]。本研究通过筛选骨质疏松性椎体骨折差异miRNA及其调控的靶基因深入研究，将有助于探索骨质疏松性椎体骨折的诊断和治疗提供新的研究思路，并为骨质疏松性椎体骨折治疗药物的研发提供较为可靠的信号通路和作用靶点。然而，本研究尚存在一些不足之处，仍需要结合大量临床样本并进行相关的基础实验进一步验证，方能完全明确这些差异miRNA和靶基因在骨质疏松性椎体骨折中的具体作用机制。