何炎峻，金圣子，王 爽，柳可欣，刘 云

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150030)

犬肿瘤疾病在临床上越来越常见，目前犬肿瘤疾病主要采用外科手术治疗，结合化疗药物治疗可明显提高宠物存活率[1-2]。顺铂(cisplatin，CP)作为一种广普抗肿瘤化疗药物，可用于治疗多种癌症。化疗药物无论在动物或者人身上，对恶性肿瘤都有明显的抑制作用[3]。CP在治疗犬乳腺肿瘤上有良好的效果，可以诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡[4]。但是CP具有严重的毒副作用，无论在人或动物的治疗上都会引起严重的肾损伤，严重降低治疗对象的生活质量，限制了CP的临床应用[5]。CP主要由肾脏代谢，通过肾小球过滤或肾小管分泌，因此，CP容易在肾脏中蓄积而造成肾损伤[6]。当发生肾损伤时，通过病理切片检查可发现肾小管上皮细胞坏死和空泡变性等肾损伤标志现象[7]。研究表明，CP能够诱导肾脏氧化应激，降低总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活性，促使肾脏中丙二醛(MDA)含量增加，破坏肾小管上皮细胞，加重肾脏损伤[8]；CP可导致肾脏中瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子κB p65(NFκB p65)和白细胞介素-1β(IL-1β)等炎症因子增多，诱导炎症损伤破坏肾小管结构，加重肾损伤[9]；CP还可诱导肾脏发生程序性坏死，从而在导致组织损伤同时诱导炎症，导致肾小管结构破坏，程序性坏死标志物受体相互作用蛋白激酶-1(RIPK1)和RIPK3在组织中的表达增加[10]。CP作为一线抗肿瘤药物，抗癌效果明显，但其副作用对肾脏造成了严重损害。因此，亟需寻找一种合适的药物来缓解CP对肾脏造成的损伤。

薯蓣皂苷元(diosgenin，Dio)是一种天然合成的淄体皂苷元，比较容易在山药中提取到，具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎的作用[11]。研究发现，Dio可以通过抑制氧化应激缓解脂多糖(LPS)诱导的肾损伤[12]；Dio不但可以减轻果糖诱导的肾脏病理组织改变，而且还可以通过缓解肾脏炎症反应缓解其诱导的大鼠肾损伤[13-14]。此外，Dio还可以缓解大鼠心肌炎症[15]。CP作为一种抗肿瘤化疗药物，找到能缓解CP诱导肾损伤的药物对临床具有重要的意义。因此，本试验通过研究Dio干预对CP诱导的肾脏的病理变化、抗氧化能力、炎症反应和细胞程序性坏死等的影响，以期为将Dio用于缓解CP诱导的肾损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

薯蓣皂苷元(Dio，纯度≥98%)(成都德赛特生物科技有限公司)；CP(Sigma-Aldrich公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(中国上海金品化工科技有限公司)；T-AOC、MDA和CAT检测试剂盒(南京建城生物工程研究所)；BCA检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗鼠TNF-α、IL-β、NFκB p65、环氧合酶-2(COX-2)、IL-10、GAPDH抗体(沈阳万类生物科技有限公司)。

倒置荧光显微镜(Echo公司)；全自动化学发光系统(Amersham Imager600，GE公司)；紫外分光光度计(Cary8454 UV-Vis，安捷伦科技有限公司)；荧光定量PCR仪(LightCycler96,Roche公司)。

1.2 动物分组及处理

选取SPF级雄性Wistar大鼠24只(辽宁长生生物有限公司)，饲养温度22～24 ℃，湿度50%～60%，室内光照12 h/12 h昼夜交替，自由采食和饮水，适应性饲养1周后进行试验。将24只大鼠随机分为4组，每组6只，分别为对照组(C)、Dio组(Dio)、模型组(CP)和Dio+CP组(Dio+CP)。C和CP组每天灌胃6 mL 0.5% CMC-Na，Dio和Dio+CP组每天灌胃Dio(60 mg/kg)[13]，连续灌胃10 d。于试验第7天，CP和Dio+CP组尾静脉单次注射CP(6 mg/kg)[16-17]，C和Dio组尾静脉单次注射2 mL生理盐水。CP给药72 h后处死大鼠，无菌分离肾脏组织，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分用液氮速冻后于―80 ℃保存备用。

1.3 氧化应激指标检测

取0.3 g肾脏组织样本匀浆，用生理盐水按照1∶9的比例进行稀释，3 500 r/min离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书测定T-AOC和CAT的活性及MDA的含量。

1.4 组织病理学检查

将固定于4%多聚甲醛中的肾脏修剪为0.5 cm，于包埋盒中流水冲洗过夜，将组织放入70%酒精2 h、80%酒精15 min、90%酒精10 min、95%酒精8 min、无水乙醇2 min进行梯度脱水，置二甲苯中6 min透明、浸蜡2.5 h，包埋后切成5 μm厚度的切片，在37 ℃水中展片，置于载玻片上，将载玻片放入二甲苯7 min、无水乙醇4 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精3 min、蒸馏水3 min进行脱蜡，HE染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理变化。

1.5 实时荧光定量PCR检测炎性因子mRNA表达

取0.1 g肾脏组织，采用总RNA提取试剂盒提取RNA并反转录合成cDNA。根据GenBank中大鼠TNF-α、NFκBp65、IL-10、COX-2和IL-1β基因的序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH为内参基因，进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系12 μL：上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.5 μL，2×TaqMasterMix 6.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

表1 引物信息

续表

1.6 Western blotting检测炎症因子蛋白的表达

将0.5 g各组肾脏组织加入含有磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，充分裂解匀浆。将匀浆4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。每组取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST漂洗3次，分别加入兔抗鼠TNF-α(1∶500)、IL-β(1∶500)、NFκB p65(1∶500)、COX-2(1∶500)、IL-10(1∶500)、GAPDH(1∶500)一抗，室温孵育12 h。然后用山羊抗兔二抗(1∶3 000)室温下孵育1 h，TBST 洗涤后置ECL发光液中显色，采用全自动化学发光系统观察并拍照，最后用ImageJ Pro Plus 5.0软件进行灰度分析。

1.7 免疫组化检测RIPK1和RIPK3蛋白的表达

取各组大鼠肾脏组织，石蜡包埋后切片(5 μm)。石蜡切片脱蜡封闭后，分别加入兔抗鼠RIPK1(1∶200)和RIPK3(1∶200)一抗，4 ℃孵育过夜；清洗后滴加山羊抗兔二抗(1∶150)，37 ℃静置30 min；洗涤后滴加DAB显色液避光显色，苏木精复染，中性树脂封片，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.8 数据统计与分析

用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法进行组间差异比较，结果用平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 Dio对CP所致大鼠肾损伤的影响

由图1可知，对照组和Dio组肾脏结构未见明显异常；CP组肾小管上皮细胞肿胀、坏死和脱落，并且肾小管发生大面积空泡变性；Dio+CP组肾小管损伤明显减轻。说明肾损伤模型构建成功。

黑色箭头指示肾小管病变

2.2 Dio对CP诱导的肾脏氧化应激的影响

由表2可知，与对照组相比，Dio组大鼠肾脏中MDA含量、T-AOC和CAT活性均无显著差异(P>0.05)，CP和Dio+CP组肾脏中MDA含量均极显著升高(P<0.01)，T-AOC和CAT活性均极显著降低(P<0.01)；与CP组相比，Dio+CP组肾脏中T-AOC和CAT活性均极显著增加(P<0.01)，MDA含量极显著降低(P<0.01)。

表2 各组氧化应激指标检测结果

2.3 Dio对CP诱导的大鼠肾脏炎症反应的影响

2.3.1 Dio对CP诱导的大鼠肾脏炎症相关因子mRNA表达的影响 由表3可知，与对照组相比，Dio组大鼠肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65、IL-1β和IL-10 mRNA的表达量均无显著差异(P>0.05)，CP组大鼠肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表达量均极显著升高、IL-10 mRNA的表达量极显著降低(P<0.01)，Dio+CP组大鼠肾脏中IL-1β mRNA的表达量显著升高(P<0.05)、IL-10 mRNA的表达量极显著降低(P<0.01)；与CP组相比，Dio+CP组大鼠肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β mRNA的表达量均显著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA的表达量极显著升高(P<0.01)。

表3 各组大鼠肾脏中炎症相关因子mRNA的相对表达量

2.3.2 Dio对CP诱导的大鼠肾脏炎症相关因子蛋白表达的影响 由表4可知，与对照组相比，Dio组大鼠肾脏中IL-1β、TNF-α、NFκB p65、IL-10和COX-2蛋白的表达量均无显著差异(P>0.05)，CP组大鼠肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表达量极显著升高、IL-10蛋白的表达量极显著降低(P<0.01)，Dio+CP组TNF-α和IL-1β蛋白的表达量分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)升高；与CP组相比，Dio+CP组大鼠肾脏中COX-2和NFκB p65蛋白的表达量显著降低(P<0.05)，TNF-α和IL-1β蛋白的表达量极显著降低(P<0.01)，IL-10蛋白的表达量极显著升高(P<0.01)。

表4 各组大鼠肾脏中炎症相关因子蛋白的相对表达量

2.4 Dio对CP诱导的大鼠肾脏中RIPK1和RIPK3蛋白表达的影响

由图2可知，RIPK1和RIPK3阳性表达呈棕黄色颗粒，对照组中RIPK1和RIPK3少量表达。由表5可知，与对照组相比，Dio组大鼠肾脏中RIPK1和RIPK3蛋白的表达水平均无显著差异(P>0.05)；CP和Dio+CP组大鼠肾脏中RIPK1和RIPK3的蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)；与CP组相比，Dio+CP组大鼠肾脏中RIPK1和RIPK3蛋白的表达分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)降低。

黑色箭头指示阳性标志物

表5 各组大鼠肾脏中RIPK1和RIPK3蛋白阳性表达率

3 讨 论

CP是一种常见的化疗药物，其抗癌广、疗效确切、无交叉耐药性，广泛应用于恶性肿瘤治疗[3]，但具有较大的副作用，无论在人或者动物上，CP治疗后均会导致严重的肾损伤[18]，亟需药物来缓解CP诱导的肾损伤，以促进CP在医疗上的应用。研究发现，CP诱导肾损伤时，直接的病理表现为肾小管上皮细胞脱落和坏死[19]。本研究结果发现，CP处理后大鼠肾小管出现大面积上皮细胞肿胀、空泡变性，表明CP破坏了肾脏结构，造成了肾损伤。王延辉等[20]研究发现，Dio可以促进肾小管受损细胞修复，增强肾脏功能，加快代谢，与本研究的结果相似。表明Dio干预显著减轻了CP诱导的肾损伤。

研究表明，CP会诱导或加剧肾脏的氧化应激损伤，造成明显肾功能紊乱、加重肾损伤[21]；CP可诱导细胞内ROS增加，当ROS在细胞内的蓄积量超出机体的清除能力时便会造成氧化应激损伤[19]；CP还会降低内源性抗氧化酶的活性，使机体总抗氧化能力降低、抗氧化与氧化作用失衡[13]。MDA是过氧化产物，可通过肾脏中MDA含量判断氧化损伤程度[22]。衡量机体抗氧化能力的指标有T-AOC和CAT活性，而Dio可以通过提高机体抗氧化酶活性而提高机体抗氧化能力[23-25]。本研究结果发现，CP可显著降低肾脏中T-AOC和CAT活性，而Dio干预则显著缓解了肾脏的氧化应激反应。曹亚军等[21]研究发现，薯蓣皂苷能显著降低衰老小鼠血清、肝脏和脑组织中MDA含量，提高机体抗氧化能力。Dio可以通过提高CAT活性和降低MDA含量缓解痛性糖尿病周围神经病变坐骨神经中氧化应激损伤[23]。本试验结果表明，与模型组相比，Dio干预显著降低了肾脏中MDA含量，提高了肾脏中T-AOC和CAT活性。以上结果均表明Dio可以通过抑制氧化应激缓解肾损伤。

给予CP会在肾脏近端小管大量聚集，引发肾脏炎症反应从而加重肾损伤[26]。一般认为IL-1β、TNF-α、COX-2和NFκB p65是肾脏中重要的促炎因子，而IL-10作为抑炎因子可以抑制炎症[27-28]。本研究结果发现，CP引发肾损伤时，大鼠肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表达显著升高，而IL-10蛋白的表达则显著降低。褚春民等[29]研究发现，TNF-α、NFκB p65和COX-2在炎症组织中蛋白的表达水平显著高于正常组织，Dio可以显著降低TNF-α、NFκB p65和COX-2的表达水平，减轻炎症。Qiao等[13]研究发现，Dio可通过降低肾脏中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β等炎症因子蛋白的表达水平缓解果糖诱导的肾损伤。也有研究表明，Dio可以提高机体IL-10抗炎因子的表达，从而发挥抗炎作用[30]。本研究结果与以上结果一致，Dio干预显著降低了肾脏组织中TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β蛋白的表达量，升高了IL-10蛋白的表达量，表明Dio能显著缓解CP诱导的肾脏炎症。程序性坏死是由基因调控的一种死亡方式，其信号调控十分复杂，目前认为RIPK1和RIPK3参与调控程序性坏死的重要过程，是程序性坏死的阳性标志物[31-32]。研究发现，RIPK1和RIPK3是程序性坏死中的重要调节物，当肾脏发生程序性坏死时，RIPK1和RIPK3蛋白在肾组织中表达升高[33]。本研究结果发现，CP处理后大鼠肾组织RIPK1和RIPK3蛋白的表达量显著升高，表明在CP诱导肾损伤的过程中程序性坏死被激活。研究表明，细胞发生程序性坏死后，细胞膜破裂导致内容物释放，内容物作为内源性危险信号(DAMPs)引发周围组织发生免疫和炎症反应[34]。在肾脏中高浓度CP可激活程序性坏死，引发肾脏炎症反应[9,35]。本研究结果发现，CP可以通过激活程序性坏死增加TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β炎症细胞因子的分泌，加重肾脏炎症反应。研究表明，抑制RIPK1和RIPK3的表达可以减轻程序性坏死[36]。也有研究表明，RIPK3基因缺陷的小鼠不能发生程序性坏死[37]。本试验结果表明，与模型组相比，Dio干预显著降低了肾脏中RIPK1和RIPK3蛋白的表达，抑制了促炎因子TNF-α、COX-2、NFκB p65和IL-1β的表达。说明Dio缓解CP诱导的肾损伤机制与其抑制程序性坏死的激活和炎症反应密切相关。

4 结 论

本研究结果表明，Dio干预可显著降低肾脏中MDA含量，降低TNF-α、COX-2、IL-1β等炎症相关蛋白及RIPK1、RIPK3蛋白的表达。说明Dio干预可缓解CP诱导的肾损伤，其作用可能与抑制肾脏氧化应激、炎症反应和细胞程序性坏死密切相关。