席 静，易继海，王月丽，徐朕宇，李培东，张江伟，陈创夫

(1.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；2.人兽共患传染性疾病防治协同创新中心，石河子 832000)

牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是导致犊牛腹泻的主要病原之一，该病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的双股RNA病毒，电镜下观察可见典型的“车轮状”，直径60～80 nm[1-2]。1968年Mebus等[3]用电镜首次从犊牛腹泻粪便中发现了BRV，证明该病毒是引发犊牛腹泻的主要病原，命名为NCDV株。随后,很多国家都发现了由BRV引起的犊牛腹泻。直到1980年吴城等[4]证实中国牛群中也存在BRV。BRV感染多发生于1月龄以内的犊牛，发病率为90%～100%，病死率最高可达50%，成年牛多呈隐性感染，该病毒还易与细菌或其他病毒混合感染，导致病情恶化、死亡率升高[5-6]。

轮状病毒由核心蛋白层、内层衣壳和外层衣壳组成。依据中间衣壳蛋白(VP6)抗原和基因的相似性，可将轮状病毒分为7个血清群(A～G群)，其中A群是引起幼龄动物腹泻最常见的抗原群[7-8]。依据细胞的蛋白酶敏感蛋白(VP4)和糖蛋白(VP7)的抗原性和基因的相似程度性，可将A群轮状病毒进一步分为P型和G型，目前已有27个G型和35个P型[9]，而中国G6、G10和P[1]、P[5]、P[11]基因型最常见，且中国已陆续分离到BRV G6P[5][10-11]、G10P[11][12-13]、G8P[1][14]及G6P[1][15-16]基因型。

轮状病毒具有变异快、基因型复杂的特点，异源与同源毒株之间均可通过重配、重排产生新毒株，甚至扩大宿主范围[17-18]。BRV的基因重组不仅会在同一物种之间发生，不同物种之间也会发生，从而导致BRV基因具有多样性[19]。这种现象也对BRV疫苗的研发和临床应用造成了严重的阻碍与挑战。因此，本研究对BRV进行分离鉴定并分析流行毒株的基因型，以期为局部地区BRV遗传演化、疫情防控及疫苗的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和细胞 于新疆北疆某规模牛场随机采集15份腹泻新生犊牛的粪便样品。Marc-145细胞(CL-0566)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。BRV阳性血清由石河子人兽共患传染性疾病防治协同创新中心保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 Rota-Corona-k99抗原检测试剂盒(IDEXX公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、TRIzol、DNA Marker、琼脂糖、Triton、5% BSA封闭液、山羊抗牛IgG-FITC、2%磷钨酸负染色液(北京索莱宝科技有限公司)；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和cDNA反转录试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；1×PBS、DMEM培养液、Hank’s液、4%多聚甲醛组织固定液(Biosharp公司)。

超净工作台(苏州净化设备厂)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；CO2细胞培养箱、微量移液器、PCR仪(Thermo公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；荧光倒置显微镜(Nikon公司)；铜网碳支持膜(北京中镜科仪技术有限公司)。

1.2 病料处理及检测

将采集的粪便样品使用Rota-Corona-k99抗原检测试剂盒进行检测。取抗原阳性的样品加入pH 7.4的PBS制成20%粪便悬液，充分振荡混匀，反复冻融3次后，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，在超净工作台中取上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌并分装至1.5 mL EP管内，-80 ℃保存备用。

1.3 病毒分离培养

取处理过的病毒液，加入终浓度为20 μg/mL的胰蛋白酶，放置37 ℃培养箱活化1 h。接种于用Hank’s液清洗过的单层Marc-145细胞中，再放回37 ℃培养箱孵育1.5 h后弃上清。加入含终浓度为5 μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM，37 ℃培养箱培养72 h，同时设置不接种病毒液的阴性对照。收集细胞及培养液，反复冻融3次离心取上清液，按上述方法继续盲传直至出现明显细胞病变效应(CPE)，当CPE>80%时收毒，-80 ℃保存备用。

1.4 病毒间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察

将Marc-145细胞提前24 h铺于6孔板中，待细胞汇合度达到80%时，将-80 ℃保存的病毒液反复冻融3次后接种于Marc-145细胞中，同时设置不接种病毒液的阴性对照。37 ℃培养48 h后，弃去上清液；每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS清洗3遍；加入1 mL 0.1% Triton通透破膜10 min，PBS清洗3遍；加入1 mL 5% BSA放置37 ℃培养箱封闭1 h，PBS清洗3遍；以BRV阳性血清(1∶50)为一抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3遍；以山羊抗牛IgG-FITC(1∶100)为二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3遍后弃去板内所有液体，荧光倒置显微镜下观察荧光并拍照保存。

将冻融3次的病毒液50 000 r/min 高速离心浓缩，取10 μL病毒液滴至铜网碳支持膜上，加入10 μL 2%磷钨酸负染色液进行负染，经透射电镜观察病毒形态。

1.5 病毒分型基因的克隆

参考NCBI中公布的BRV的VP6和VP7基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物(表1)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TRIzol Reagent法提取病毒分离株的总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL：cDNA模板2 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，退火(退火温度见表1)30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化目的条带，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 引物信息

1.6 基因序列分析

将VP6和VP7基因测序结果分别在NCBI中进行BLAST比对，选取参考毒株基因，用DNAStar软件的Clustal Ⅴ方法进行核苷酸序列相似性分析，并运用Mega 6.0软件绘制基因遗传进化树。

2 结 果

2.1 病毒分离培养

Rota-Corona-k99抗原检测试剂盒结果显示，有3份样品呈BRV抗原阳性，将阳性样品经处理后分别接种于Marc-145细胞，仅有1份样品盲传至第5代时出现不明显的CPE，传至第9代CPE稳定且明显。正常Marc-145细胞呈扁平不规则的多边形，形态清晰，24 h即可长成致密单层(图1A)。将病毒液接种于Marc-145细胞，36 h时出现CPE,表现为胞浆相连、拉网、边界不清晰并伴随细胞空斑的形成(图1B)；72 h时CPE更明显，细胞皱缩脱落、细胞间质颗粒增多(图1C)。表明从腹泻犊牛的粪便样品中成功分离获得了1株使细胞产生CPE的毒株。

A，正常Marc-145细胞；B，接种病毒液36 h时CPE；C，接种病毒液72 h时CPE

2.2 分离株IFA和电镜观察

IFA检测结果显示，不接种病毒液的Marc-145细胞未见荧光(图2A)，接种病毒液的Marc-145细胞胞浆内有亮绿色的荧光(图2B)，初步确定抗原为BRV。电镜观察结果显示，该病毒形态呈球形、无囊膜，有经典的“车轮状”，直径约65 nm(图3)。由此确定获得的分离株为BRV，并命名为XJ-2022。

A，正常Marc-145细胞；B，感染病毒液的Marc-145细胞

图3 分离株电镜观察结果(20 000×)

2.3 VP6和VP7基因PCR扩增

用特异性引物对XJ-2022分离株进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳可获得与预期大小的目的条带(图4)。经过序列测定，获得1 356 bp的VP6全基因序列及342 bp的VP7部分基因序列。

M,Super DNA Marker；1、3，阴性对照；2，VP6基因；4，VP7基因

2.4 VP6基因相似性比对和进化树分析

用DNAStar软件的Clustal Ⅴ方法，将XJ-2022株VP6基因的核苷酸序列与其他参考毒株进行相似性比对，结果显示,XJ-2022株VP6基因与参考株DB2015-066(LC367318.1,泰国/2015,人,A群)相似性最高,为98.4%；其次是参考株A44(LC133573.1,泰国/1989，牛，A群)、61A(LC133540.1,泰国/1989，牛，A群)和22R(AB040055.1,日本/2003，牛，A群)，相似性为95.5%；与其他A群参考株核苷酸相似性均≥95%(图5)。遗传进化树显示，XJ-2022分离株与参考株DB2015-066(LC367318.1,泰国/2015，人，A群)聚为一小分支，与其他A群轮状病毒虽在一个大的分支上，但在遗传进化上仍存在一定距离(图6)。表明XJ-2022株VP6基因型为A群轮状病毒。

图5 XJ-2022株与其他轮状病毒参考毒株VP6基因核苷酸序列相似性比对

图6 XJ-2022株与其他轮状病毒基于VP6基因的进化树

2.5 VP7基因相似性比对和进化树分析

将XJ-2022株VP7基因的核苷酸序列与其他参考毒株进行相似性比对，结果显示，XJ-2022株VP7基因和参考株XJX2(MN937506.1,中国/2018，牛，G10型)和61A(LC133541.1,泰国/1989，牛，G10P[5]型)相似性最高,为98.1%；其次是参考株A44(LC133574.1,泰国/1989，牛，G10P[11]型)和1254(JN007406.1,意大利/2005，牛，G10型),相似性为97.5%；与HY-13(MK638905.1,中国/2017，耗牛，G10型)相似性为97.1%；与其他G10型轮状病毒核苷酸相似性均>93%(图7)。遗传进化树显示，XJ-2022分离株与参考株XJX2(MN937506.1，中国/2018，牛，G10型)聚为一小分支，与61A(LC133541.1，泰国/1989，牛，G10P[5]型)聚为一个次级分支，与其他G10型轮状病毒在遗传进化上存在一定距离(图8)。表明XJ-2022株VP7基因型为G10型轮状病毒。

图7 XJ-2022株与其他轮状病毒参考毒株VP7基因核苷酸序列相似性比对

图8 XJ-2022株与其他轮状病毒基于VP7基因的进化树

3 讨 论

轮状病毒侵入细胞时主要通过胞浆膜直接进入胞浆，穿入细胞膜依赖于外层衣壳蛋白VP4，而VP4蛋白需在胰蛋白酶作用下裂解为VP5和VP8 2个亚基，VP5能增加细胞膜的渗透性，VP8使病毒吸附于细胞表面，进而提高轮状病毒侵入效率。而VP7蛋白具有稳定VP4结构的作用可与细胞受体结合，加速轮状病毒侵入细胞[8,20]。然而除A群轮状病毒能在体外进行细胞培养外,其他毒株迄今还未在体外培养成功,只能通过感染易感动物来分离和复制病毒[6]。轮状病毒的细胞培养主要依附于胰蛋白酶处理适应细胞[21-22]。牛源轮状病毒的分离比其他物种相对容易,但仍需用胰蛋白酶处理病毒及维持液中加入低浓度胰蛋白酶增加病毒对细胞的易感性[22]。而不同毒株对胰蛋白酶的敏感性也不相同，在病毒分离时所加入胰蛋白酶终浓度和活化接种时间需根据毒株进一步摸索验证。

本研究采用Marc-145细胞对BRV进行体外细胞分离。维持液中胰蛋白酶终浓度摸索过1、3、5和10 μg/mL，其中1、3 μg/mL胰蛋白酶在接种后第6代也未出现CPE，经PCR扩增发现分别从第2和4代后未出现目的条带。而用10 μg/mL胰蛋白酶接种后24 h细胞基本脱落死亡。本研究用维持液的胰蛋白酶终浓度5 μg/mL，盲传9代后分离出BRV。表明高浓度的胰蛋白酶会对病毒和细胞造成一定程度的伤害，但胰蛋白酶浓度过低也会降低病毒的感染性造成病毒在传代中丢失。

轮状病毒的基因重配是其进化的主要方式，具有变异快、基因型复杂的特点，异源毒株与同源毒株之间均可通过重配、重排产生新毒株，甚至扩大宿主范围[11]。目前已有文献显示，人、牛、猪轮状病毒均有基因重配现象的发生[18]。2013年Park等[23]从韩国腹泻牛群中分离到的30株G6、G8型BRV，经相似性分析发现其中有1～9个基因片段来源于人或猪。同年Ghosh 等[24]从日本分离的马源轮状病毒(OH-4)，其中VP7、VP4、VP3、NSP1、NSP3和NSP5基因均来自于牛源轮状病毒。2021年曹存等[11]从黑龙江腹泻犊牛中分离的BRV(DZ株)，其中VP1、VP4、VP6、NSP2和NSP4基因与牛、人、犬和山羊来源的基因序列相似性最高，为多元重配病毒，再一次证实了基因重配在轮状病毒进化和种间传播上的作用。本研究分离的XJ-2022株VP6基因与泰国人源A群轮状病毒DB2015-066(LC367318.1)相似性最高且遗传进化亲缘关系最近，与其他A群参考株遗传进化相对较远，而VP7基因却与中国牛源G10型轮状病毒XJX2(MN937506.1)相似性最高且遗传进化亲缘关系最近。以上结果表明XJ-2022株是人和牛多元重配病毒，其基因型为A群G10型轮状病毒。2008年常继涛等[12]和2019年张迎春等[25]已从新疆腹泻犊牛粪便中分离到BRV G10型基因，进一步证实G10型BRV为新疆主要的流行株。而XJ-2022株则是首次从新疆地区发现的多宿主来源的基因重配病毒，也进一步证实轮状病毒的不同节段在种间和种内均可交换，形成新基因型的轮状病毒。

4 结 论

本研究成功分离到基因型为A群G10型的BRV XJ-2022株，该分离株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒，为新疆BRV的遗传进化及分子流行病学研究奠定基础，也为BRV疫苗研究提供候选毒株。