刘 刚，朱芳贤，章晓炜，顾 峰，刘莉君，苏 锐，孟 飞，许海涛，孙飞舟

(1.全国畜牧总站，北京 100193；2.浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站，杭州 310021；3.苏州太湖东山湖羊产业发展有限公司，苏州 215107)

近年来，超低温冷冻保存技术对畜禽遗传资源保种的贡献越来越大，在畜禽遗传资源保护中发挥了重要作用[1-6]：①超低温冷冻保存技术保种可以规避风险，大量回收供体的配子和胚胎，提高安全性，可以克服活体保种中疫病、自然灾害 (干旱、水灾、战争爆发等)等因素造成的保种困难；②实现了遗传材料的超低温保存，可长时间完整保存畜禽的遗传信息，防止漂变。目前配子和胚胎冷冻保存的年限为200年以上，尤其是活体保种过程中群体有效含量降低到一定水平后，受近交和遗传漂变等因素的制约，活体保种很难成功；③提高了保种效率，省时省力，节省资金，快速抢救性地保护了更多的濒危畜禽遗传资源。1992年，受世界银行中国农业支持服务项目资助，中国开始利用超低温冷冻技术保存畜禽的精液、胚胎和体细胞等遗传材料。截至2021年底，国家家畜基因库中畜禽遗传资源冷冻精液、冷冻胚胎、体细胞等遗传材料保存总量达到120万余份，跃居世界首位。湖羊是中国特有的羔皮用绵羊品种，也是世界著名的多羔绵羊品种，具有性成熟早、繁殖力高、宜舍饲等优良特性[7]。据国家畜禽遗传资源品种名录(2021版)统计，中国绵羊有地方品种44个、培育品种33个、引入品种13个。为了检验长期保存的湖羊冷冻胚胎和冷冻精液的制作和保存质量，评价超低温冷冻保存技术保种的效果，同时为保种场扩充血缘，本试验对国家家畜基因库长期保存的湖羊冷冻胚胎和冷冻精液进行复苏利用，对后代开展性能测定，验证其遗传材料长期超低温保存效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 孕酮阴道栓(CIDR)，新西兰DEC国际有限公司生产，1.9 g/支，批号：2017.11.20；氯前列烯醇(PG)，上海市计划生育科学研究所生产，0.2 mg/2 mL/支，批号：2017.06.13；孕马血清促性腺激素(PMSG)，宁波三生药业有限公司生产，1 000万IU/支，批号：2016.12.15；促黄体素释放激素A3(促排卵3号)，宁波三生药业有限公司生产，20 μg/支，批号：2017.07.12；精液稀释剂，法国卡苏公司生产，批号：2018.02.23。

1.1.2 试验用冷冻胚胎和冷冻精液 湖羊种羊群体的冷冻胚胎和冷冻精液在浙江余杭湖羊场(现国家湖羊保种场)和浙江吴兴种羊场进行制作，并保存于国家家畜基因库。本次研究使用试验材料为1998年制作保存20年的冷冻胚胎36枚，1988年制作保存30年的安瓿冷冻精液27剂(30年冷冻精液组)，1998年制作保存20年的0.25 mL细管冷冻精液75剂(20年冷冻精液组)。

1.1.3 试验动物 为了更好地与目前的湖羊对照，试验选择在湖羊原产地国家级保种场和保护区及省级保种场进行，胚胎移植受体羊、冷冻精液配种受体羊、鲜精配种和本交配种受体羊都选择纯种湖羊，其胎次在2～4胎、遗传背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)的公羊和空怀母羊。2018年3月初开始受体羊选择并单独组群，最终选择了18只公羊和160只母羊，提供相同的饲养管理方式。

1.2 方法

1.2.1 受体羊同期发情处理 胚胎移植受体采用CIDR+PG+PMSG同期化处理，放栓日为第1天，放栓后第12天撤栓，同时注射PG 1支、PMSG 300 IU，撤栓后24 h观察发情(用公羊试情)，发情后注射促排卵3号 1支。冷冻精液人工授精和本交试验羊采用CIDR+PG同期化处理。

1.2.2 胚胎移植

1.2.2.1 冷冻胚胎解冻及鉴定 ①冷冻胚胎解冻及鉴定：从液氮罐中取出装有胚胎的细管，室温下放置10 s后投入32～35 ℃水浴中2 min。用消毒纸巾擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿中，然后将胚胎依次移入分别含有6%、3%、0甘油的0.1 mol/L蔗糖的PBS解冻液中，分别停留5 min，最后用保存液洗3次，镜检。胚胎质量依据《牛羊胚胎质量检测技术规程(NY/T 1674—2008)》进行鉴定，根据胚胎内细胞团的卵裂球轮廓清晰度、明暗度，细胞密度及卵裂均匀度等形态结构判断级别。发育正常的胚胎，其卵裂球轮廓清晰，明暗度适中，细胞密度大，卵裂均匀，细胞变性率不超过10%，划分为A级胚胎；胚龄与发育期基本吻合，轮廓清晰，明暗适中或稍暗或稍淡，细胞密度较小或小型卵裂球过多，细胞变性率为10%～20%，划分为B级胚胎；轮廓不清晰，色泽过暗或者过淡，细胞密度小，细胞变性率为30%～40%，划分为C级胚胎；退化胚、变性胚划分为D级胚胎。

1.2.2.2 胚胎移植 参考《羊胚胎移植技术规程(NY/T 1571—2007)》进行胚胎移植，每个受体移植1～3枚胚胎。

1.2.3 冷冻精液解冻及人工授精

1.2.3.1 试验分组 试验分为30年冷冻精液组、20年冷冻精液组、0年冷冻精液组、鲜精组和本交组。其中鲜精组精液采集于国家湖羊保种场的12只湖羊公羊，采用相差显微镜目测，精子活力达到0.6以上进行后续试验。0年冷冻精液组的精液采集于国家级湖羊湖羊保护区(江苏)的6只公羊，供体公羊均为随机选择，其繁殖性能正常，0年冷冻精液制成后存放于液氮中保存备用，使用时解冻后用相差显微镜目测，其解冻后精子活力在40%以上进行后续试验。本交组公羊来源于国家湖羊保护区(江苏)，随机选择10只采取本交方法配10只试验母羊，用于后代生长发育和后代繁殖性能等的比较。

1.2.3.2 冷冻精液解冻及精液质量鉴定 30年安瓿冷冻精液解冻方法为在60 ℃温水中快速解冻14 s，20年和0年的0.25 mL细管冷冻精液解冻方法为在38 ℃温水中解冻15 s。冷冻精液质量依据《山羊冷冻精液(GB 20557—2006)》对精液活力、密度和畸形率等指标进行检测。

1.2.3.3 人工授精 将不同组的精液稀释到每毫升精液中直线向前运动精子数在3 000万个左右，采用内窥镜子宫角输精手术进行人工授精，每只羊输入0.7 mL，含2 400万个直线运动精子。

1.2.4 胚胎移植羊和冷冻精液后代羔皮性能评定 羔皮性能以一级羔皮率指标评价，根据《小湖羊皮(GB/T 14629.1—2018)》和《湖羊(GB 4631—2006)》标准对试验羊及后代羊的花纹类型、花纹面积、花纹宽度、毛长、花纹紧密度、羔皮等级进行鉴定并给予等级评定。

1.2.5 胚胎移植羊和冷冻精液后代生长发育测定 根据《绵、山羊生产性能测定的技术规范(NY/T 1236-2006)》标准对胚胎移植羊和冷冻精液后代的初生重、断奶重、6月龄体重和体尺等指标进行测定。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析,用Duncan氏法进行组间多重比较，试验结果以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 胚胎保存效果

2.1.1 复苏胚胎形态鉴定 本试验共解冻胚胎36枚，其中，A级胚胎22枚，B级胚胎7枚，C级胚胎5枚，D级胚胎2枚。按C级以上为有效胚胎计，冷冻胚胎复苏利用率达到94.44%(34/36)，A级胚胎率达到61.11%(22/36)。

2.1.2 胚胎移植效果及后代羔皮性能 从2018年8月29日开始胚胎移植试验，对19只符合移植的受体母羊进行移植，13只怀孕分娩，受胎率为68.42%；共移植胚胎34枚，出生17只羔羊，没有畸形个体，胚胎复苏移植产羔率为50.00%，成活羔羊16只，羔羊成活率为94%，一级羔皮率为31.25%，经过鉴定，其体型外貌符合纯种湖羊特征，并保持了当年湖羊的羔皮特性。

2.2 精液保存效果

2.2.1 精液质量检测 30年冷冻精液组、20年冷冻精液组、0年冷冻精液组、鲜精组精液检测结果见表1。30年和20年冷冻精液组精子活力均高于30%，且30年冷冻精液组精子活力高于20年组。

表1 精液质量检测结果

2.2.2 冷冻精液配种后代性能 由表2可知，试验中保存30年的冷冻精液受胎率为58.57%，羔羊一级羔皮率为42.03%，毛色更加洁白、波浪形花纹更加明显，再现了30年前湖羊羔皮性能的典型特征；保存20年冷冻精液受胎率为53.66%，羔羊一级羔皮率为23.81%，二者后代均没有畸形个体；保存30年冷冻精液受胎率均极显著高于20年和0年冷冻精液组(P<0.01)，极显著低于鲜精组和本交组(P<0.01)。保存30年冷冻精液羔羊一级羔皮率极显著高于其他组(P<0.01)。

表2 试验羊受胎产羔情况及后代羔皮性能

2.3 胚胎移植羊和冷冻精液后代生长发育和繁殖情况

2.3.1 胚胎移植羊和冷冻精液后代生长发育情况 由表3可知，胚胎移植羊初生重、断奶重、6月龄体重、体高和胸围等指标均高于其他组(P<0.05)，30年冷冻精液和20年冷冻精液组后代初生重、断奶重、6月龄体尺与0年冷冻精液、鲜精组和本交组差异均不显著(P>0.05)。本交组后代初生重、断奶重、6月龄体重、6月龄体高和6月龄胸围等指标低于胚胎复苏羊、30年冷冻精液和20年冷冻精液组(P<0.05)。

表3 胚胎移植羊和冷冻精液后代生长发育情况

2.3.2 胚胎移植羊和冷冻精液后代繁殖情况 由表4可知，试验出生的9只胚胎移植羊母羊100%受胎产羔，其后代平均产羔数和繁殖成活率都高于鲜精组和本交组(P<0.05)，一级羔皮率明显高于鲜精组和本交组(P<0.01)，也高于30年和20年冷冻精液组(P<0.05)。30年和20年冷冻精液组后代都能正常受胎产羔，受胎率高于鲜精组和本交组；30年和20年冷冻精液组平均产羔数和繁殖成活率低于鲜精组和本交组，但差异均不显著(P>0.05)，30年冷冻精液组的一级羔皮率高于20年冷冻精液组(P<0.05)，30年冷冻精液组的一级羔皮率高于鲜精组及本交组(P<0.01)，20年冷冻精液组也高于鲜精组和本交组(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 胚胎保存效果分析

胚胎超低温冷冻保存是在极低的温度(—196 ℃)下保存动物胚胎，处于超低温下的胚胎新陈代谢几乎完全停止，可以达到长期保存的目的。学者们先后在牛[8]、绵羊[9]、山羊[10]、马[11]、猪[12]等畜种进行了冷冻保存试验，并得到移植后代。朱士恩等[13]将小鼠扩张囊胚分别在液氮中冷冻保存1 h、1年和2年，解冻后囊胚形态恢复率分别为100%、98%和98%。本试验中冷冻胚胎复苏利用率达到91.67%，A级胚胎率达到33.3%，表明胚胎长期保存后也有好的恢复率。胚胎冷冻保存10年以上进行移植在中国还未有报道，Whittingham等[14]开展了小鼠胚胎的长期冷冻试验，将小鼠胚胎的冷冻时间延长到8个月，并对胚胎进行异地移植，获得成功。王光亚等[15]对奶山羊的胚胎进行长期冷冻保存，将冷冻保存的时间延长到819 d，成功获得成活羔羊。尹海科等[16]报道冷冻8年的布尔山羊胚胎移植成功，胚胎复苏移植产羔率为41%，以上报道表明胚胎冷冻保存后可以复苏。胡振尉等[17]在1985年制作湖羊保种胚胎时解冻34枚胚胎，有24枚可以利用(占70.58%)，其中10枚胚胎用外科手术法移植给3只受体母羊，2头怀孕，受胎率66.6%，产活羔3只，胚胎复苏移植产羔率33.3%，低于本试验胚胎复苏移植产羔率50.00%，因此本试验也表明胚胎长期冷冻保存后可以复苏，且随着繁殖技术提高也可以获得好的冷冻胚胎复苏移植效果。

3.2 冷冻精液保存效果分析

本试验结果显示，保存30年和20年的冷冻精液，解冻后活力均在30%以上，与制作时(1988年和1998年)的活力相当。冷冻精液质量检测结果中，20年冷冻精液活力低于30年冷冻精液，可能因为30年冷冻精液是以安瓿为载体，制作时(1988年)技术成熟，而20年冷冻精液是以细管为载体，制作时(1998年)是才开始研究推广的技术。配种试验结果表明，保存30年和20年冷冻精液受胎率都达到了制作年代的受胎率。胡振尉等[17]1985年开展了湖羊冷冻精液的输精试验，其情期受胎率在36.5%～75.0%，其中保存30年冷冻精液比20年受胎率高，与保存30年的活力高于20年的相关；保存30年和20年冷冻精液的后代成活率与鲜精组和本交组的后代成活率基本一致。以上结果说明冷冻精液长期保存后质量和配种效果变化不明显。

3.3 胚胎移植羊和冷冻精液后代遗传性能和适应性

试验结果显示，30年冷冻精液后代一级羔皮率高于20年胚胎移植羊和20年冷冻精液后代以及鲜精组和本交组；胚胎移植羊一级羔皮率是31.25%，高于2019年湖羊保种场的26.05%(242/929)，与1989年制作胚胎时保种场的湖羊一级羔皮率(34.08%)相当(数据来源于余杭保种场1989年测定数据)，试验结果充分说明胚胎移植羊和冷冻精液后代保持了当年湖羊羔皮特性。本试验羔皮等级结果符合湖羊养殖发展历史，即从20世纪90年代后期开始，由于市场需求，湖羊选育目标以肉用为主，羔皮性能不再是主要指标，一级羔皮率有所下降。后代生产性能测定结果显示，胚胎移植羊初生重、断奶重、6月龄体重等指标均高于其他组，可能是由于母羊产羔数少，羔羊得到更多的母乳。冷冻精液后代各项指标与鲜精组及本交组差异不显著，胚胎移植羊100%受胎产羔，30年和20年冷冻精液后代都能正常受胎产羔，受胎率与鲜精组及本交组差异不显著，以上结果说明胚胎移植羊和冷冻精液后代可以适应当前的生存环境，并能正常生长和繁殖。下一步将利用分子生物学方法[6,18-21]对后代羊进行深入分析。

4 结 论

本研究对保存20年的湖羊冷冻胚胎、20年和30年的冷冻精液进行复苏，并连续跟踪近2年，对胚胎移植羊和冷冻精液后代生长、繁殖性能进行测定，其冷冻胚胎复苏率超过94%，冷冻精液复苏后活力均超过30%；胚胎移植羊和冷冻精液后代体型外貌鉴定均符合纯种湖羊特征，保持了湖羊原来的外貌特征，尤其是保持了当年的羔皮性能；其后代生长发育及繁殖性能与现在的湖羊基本保持一致。研究充分证实了利用超低温冷冻技术长期保存湖羊冷冻精液和冷冻胚胎的方法是可行的，这是畜禽保种方式的重大突破，对地方品种保种具有重要意义。

致 谢：江苏省畜牧总站张志峰，浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站马敏彪和刘雅丽，浙江华丽牧业有限公司白丽华和白慧琴，长兴永盛牧业有限公司胡志宏，天津市畜牧研究所张效生等参与了大量基础性工作。