王帅杰，谭子涵，李晗博，孙香雪，艾思含，王 蕾,2，赵 迪,2，侯永清,2

(1.武汉轻工大学，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉 430023；2.武汉轻工大学，动物营养与饲料安全湖北省协同创新中心，武汉 430023)

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是冠状病毒的一种，感染仔猪后会导致猪流行性腹泻(PED)，主要症状表现为呕吐、泄泻和脱水[1]。所有年龄阶段的猪都可能感染PEDV，其中幼龄仔猪由于发育不完全而最容易被感染，且感染后的仔猪发病率高达100%，死亡率更是超过了80%[2]。在中国，从20世纪80年代后期以来，由于PEDV感染死亡的仔猪已经超过了一百万头，对养猪业造成了极大的负面影响[3]。PEDV主要在小肠绒毛的细胞浆中复制，在隐窝和肠系膜淋巴结中也有少数增殖。PEDV感染增殖会导致细胞变性和绒毛萎缩，进而引起腹泻，使小肠的吸收面积减少，导致小肠吸收功能损伤进而引起机体对营养物质的吸收障碍[4]。

槲皮素又名栎精，是自然界中最丰富的饮食类黄酮类化合物，其化学结构中包含5个羟基，可以与机体中代谢产生的自由基中和，具有很强的抗氧化作用[5]。黄思莹等[6]研究发现,添加高剂量的桑叶槲皮素可以显著提高小鼠血浆中的抗氧化酶活性，显著降低小鼠血浆中丙二醛(MDA)等氧化产物的含量。槲皮素也有一定的抗病毒作用，有研究表明，在单层细胞培养中，添加槲皮素可抑制多种病毒对细胞的感染，并且可以抑制病毒在细胞内的复制[7]。作者所在研究团队同期研究发现，在仔猪饲粮中添加槲皮素能够缓解因PEDV感染导致的平均日增重下降，降低仔猪粪便形态评分及仔猪腹泻率[8]。本试验旨在研究槲皮素对PEDV感染仔猪肠道的保护作用，为槲皮素在早期断奶仔猪生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

PEDV(YN株)，由武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室保存；槲皮素购自MCE公司(纯度>98%)；奶粉购自纽瑞滋食品(上海)有限公司，其营养水平见表1。

表1 奶粉营养水平

1.2 试验动物与试验设计

试验选用18头平均体重为(2.67±0.15)kg的7日龄(杜×长×大)健康仔猪，将仔猪随机分入3个处理组:对照组、PEDV组和槲皮素+PEDV组(Que+PEDV)，每个处理组6个重复，每个重复1头猪。试验期8 d，各组仔猪均自由采食人工奶(将奶粉与45～55 ℃温水按照1∶5的比例冲泡混匀)，于每天08:00、11:00、15:00、18:00和21:00饲喂。于试验第1～7天，每晚19:30给槲皮素+PEDV组仔猪口腔灌服槲皮素(溶于人工奶中，剂量为10 mg/kg BW[9-10])，对照组和PEDV组仔猪灌服同等体积的人工奶。于试验第5天早上06:00称重，晚上20:30向PEDV组和槲皮素+PEDV组仔猪口腔灌服PEDV(毒价为104.5TCID50，溶于PBS溶液中)，对照组仔猪灌服同等体积的PBS溶液。于试验第7天晚上22:00断水断料，第8天早上06:00空腹称重，然后用戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)肌肉注射麻醉并屠宰取样。

1.3 饲养管理

试验在武汉市畜牧兽医研究所的三级生物安全实验室进行，试验开始前对猪舍猪笼及墙面地面进行彻底清洗和消杀，并对整个空间进行熏蒸消毒。试验期间保持温度稳定在26～28 ℃，使用动物房的通风系统保持空气流动,对照组仔猪与PEDV感染仔猪分猪舍饲养，严格控制对照组和攻毒组之间的接触，保证不会出现交叉感染。每个组的猪笼配有单独的保温灯和不锈钢料盆，每次进出喂食和观察之后都要进行消毒且每天早晚对猪舍各进行1次清洗，并使用戊二醛癸甲溴铵、聚维酮碘、百毒杀等消毒液进行交替消杀。每天观察和记录仔猪的采食情况、精神状态及腹泻状况。

1.4 样品采集与处理

于试验第8天屠宰取样，将仔猪麻醉后置于冰板上解剖，取出十二指肠、空肠、回肠和结肠，用生理盐水将每段肠道清洗干净并用滤纸吸干，每个肠段剪取3和10 cm左右的相邻两小段，3 cm肠段放入4%的甲醛溶液中固定，经过石蜡包埋和HE染色后制成病理切片待后续肠绒毛形态结构的观察；10 cm肠段沿肠系膜纵向剪开，用生理盐水清洗干净，将洗净的肠段放置于冰板上用滤纸吸干并剪碎，用灭菌锡箔纸包装3～5包并放入液氮中速冻，然后转移到-80 ℃冻存待测。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 小肠黏膜形态结构 参照Frankel等[11]方法测量肠绒毛的相关数据，每张肠道切片选取8根长度最长、轮廓清晰且结构完整的肠绒毛，采用OLYMPSBX-41TF型显微镜和千屏高清晰度彩色病理图文分析系统[12]测量仔猪小肠的绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度与隐窝深度的比值。

1.5.2 肠道抗氧化指标 测定十二指肠、空肠、回肠、结肠的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、髓过氧化物酶(MPO)活性和MDA含量，以上指标检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 空肠脂质代谢功能相关基因相对表达量 各检测基因的引物序列见表2。用核糖体蛋白L4(RPL4)基因作为内参，检测载脂蛋白A1(APOA1)、载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白C2(APOC2)、脂肪酸结合蛋白2(FABP2)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员3(ACSL-3)和脂肪酸合酶(FASN)基因的相对表达量。将空肠组织样品于液氮中研磨，用RNAiso Plus试剂提取总RNA，并使用微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop 2000)测定RNA的浓度和纯度。根据PrimeScript®RT Reagent Kit with gDNA Eraser操作步骤将总RNA逆转录成cDNA，按照SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)试剂盒方法配制实时荧光定量PCR反应体系(以上试剂盒均购自TaKaRa公司)，反应程序:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。参照Fu等[13]方法计算、分析检测结果。

表2 引物信息

1.6 数据统计分析

利用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，探究槲皮素对PEDV感染仔猪肠道形态结构、肠道抗氧化能力以及空肠脂代谢相关基因表达量的影响，差异显著时采用Duncan’s法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准，以P<0.01作为差异极显著判断标准。

2 结 果

2.1 槲皮素对PEDV感染仔猪肠道形态结构的影响

由图1可知，与对照组相比，PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低(P<0.01)；与PEDV组相比，槲皮素+PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度及绒毛高与隐窝深度比值极显著提高(P<0.01)。

与对照组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01);无*表示差异不显著(P>0.05)。与PEDV组相比，#，差异显著(P<0.05)；##，差异极显著(P<0.01);无#表示差异不显著(P>0.05)。下同

通过观察仔猪小肠光学切片图像发现，对照组仔猪小肠绒毛相对比较整齐规则，隐窝较浅、结构清晰；与对照组相比，PEDV组空肠形态结构损伤严重，绒毛基本全部脱落，隐窝较深、轮廓欠清晰；与PEDV组相比，槲皮素+PEDV组空肠绒毛损伤程度较轻，部分绒毛结构相对完整。图2为选取的各组仔猪空肠光学切片图像。

图2 各组仔猪空肠光学切片图像(100×)

2.2 槲皮素对PEDV感染仔猪肠道抗氧化指标的影响

由表3可知，与对照组相比，PEDV组仔猪空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD活力均显著降低(P<0.05)，十二指肠、空肠、回肠和结肠中CAT活力显著降低(P<0.05)，回肠和结肠中MDA含量显著增加(P<0.05)。

表3 各组仔猪肠道抗氧化指标测定结果

续表

与PEDV组相比，槲皮素+PEDV组仔猪空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD活力显著提高(P<0.05)，十二指肠、空肠和结肠中CAT活力显著提高(P<0.05)，回肠和结肠中MDA含量显著减少(P<0.05)。

2.3 槲皮素对PEDV感染仔猪空肠脂质代谢功能相关基因相对表达量的影响

由表4可知，与对照组相比，PEDV组仔猪空肠中APOA1、APOB、APOC2、FABP2、ACSL-3和FASN基因的相对表达量均极显著下调(P<0.01)；与PEDV组相比，槲皮素+PEDV组仔猪空肠中APOB、FABP2和FASN基因的相对表达量均极显著上调(P<0.01)。

表4 各组仔猪空肠脂代谢相关基因表达量测定结果

3 讨 论

3.1 槲皮素对PEDV感染仔猪肠道形态结构的影响

保持肠道形态结构的完整性对维持仔猪的肠道屏障功能十分重要。肠道屏障不仅是动物机体自身免疫系统的一个主要组成部分，还是动物机体防御外来病菌侵袭皮肤黏膜时的第一道天然有效的防护屏障[14]。新生仔猪由于肠道结构和功能发育并不完全，容易受到外界因素的刺激而产生应激反应，因此极易被PEDV感染，进而导致仔猪肠道受损以及肠绒毛萎缩脱落并引发腹泻。槲皮素属于黄酮类物质，有研究表明，在日粮中添加适量黄酮类物质，可以有效改善仔猪的肠道环境，缓解因断奶等引起的应激反应，提高畜禽的生产性能。大豆异黄酮可以维持肠道中微生物的平衡，提高机体对营养物质的消化吸收，改善仔猪断奶期间的应激状况[15]。竹叶黄酮可以有效地缓解仔猪的腹泻症状，促进肠道的自我修复，提高仔猪对饲料的吸收利用和平均日增重，从而改善仔猪的生产性能[16]。绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度与隐窝深度比值是衡量肠道形态结构的重要指标，已有研究表明，在仔猪饲料中添加槲皮素可以促进仔猪肠上皮细胞的增殖，增加猪肠上皮绒毛的数量，维持肠道形态结构的完整性[17]。其途径可能是由于黄酮类化合物可以抑制细胞的凋亡，降低机体肿瘤坏死因子α的表达，从而促进损伤部位愈合[18]。

本试验结果显示，PEDV组仔猪空肠、回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低，这表明PEDV感染破坏了仔猪正常的肠道形态结构。而口腔灌服槲皮素缓解了因PEDV感染引起的仔猪空肠、回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值的降低，表明槲皮素可以缓解因PEDV感染引起的肠道损伤，对仔猪维持正常的肠道形态结构有一定的作用。

3.2 槲皮素对PEDV感染仔猪肠道抗氧化指标的影响

PEDV感染仔猪后会激活肠道上皮细胞合成和释放细胞因子和炎性介质，抑制抗氧化酶类的活性，导致机体脂质过氧化并产生大量氧自由基，进而对细胞造成氧化损伤[19-20]。槲皮素属于黄酮类化合物，富含酚羟基，能够提供大量的氢离子与机体代谢产生的氧自由基相结合进而有效清除自由基，还可以通过有效控制氧化酶的活性和有效提高抗氧化酶的氧化活力来进一步发挥其抗氧化作用[19]。黄思莹等[6]通过探索桑叶槲皮素对D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的研究发现，高剂量桑叶槲皮素组小鼠血清中T-AOC水平、GSH-Px和SOD活性显著提高，MDA含量显著减少;另有研究表明，在冷冻保护剂中添加槲皮素能够提高羊卵巢组织的CAT活性[21];占今舜等[22]研究发现，添加槲皮素能够显著提高LPS刺激下山羊瘤胃细胞T-AOC、CAT、SOD和GSH-Px的活性。这些研究表明槲皮素能够通过提高抗氧化酶类活性来缓解氧化损伤。

本试验发现，PEDV组仔猪肠道氧化产物MDA的含量显著增加，仔猪肠道CAT、T-SOD、GSH-Px等氧化相关酶的活性显著降低。说明PEDV感染降低了仔猪肠道抗氧化能力，造成了机体的氧化损伤。口腔灌服槲皮素能够缓解PEDV感染导致的仔猪肠道MDA含量增加和CAT、T-SOD、GSH-Px活性降低，说明槲皮素对PEDV感染导致的仔猪肠道氧化损伤有缓解作用，能够提高仔猪肠道的抗氧化能力。

3.3 槲皮素对PEDV感染仔猪空肠脂质代谢功能相关基因相对表达量的影响

已有研究证明，PEDV感染会引起仔猪严重腹泻甚至死亡，也会造成小肠绒毛损伤，导致仔猪肠道吸收功能出现障碍。脂质是机体重要的营养物质之一，脂质的吸收以及脂肪酸的运输对机体的生长至关重要。载脂蛋白(APO)是一类能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的蛋白质，在脂质的储存与转运中发挥重要作用[23]。脂肪酸结合蛋白(FABP)的主要功能是参与长链脂肪酸的摄取、细胞内的代谢和运输，同时也参与细胞生长与增殖过程[24]。FASN可以催化乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成脂肪酸，在脂肪的代谢过程中发挥着重要作用[25]。有研究表明，在肉鸡饲粮中添加槲皮素可以通过影响脂肪消化和吸收、脂肪酸代谢、AMPK信号通路来调节脂质代谢，进而提高肉品质[26]。此外，已有研究证明槲皮素能够促进畜禽对蛋白质、脂肪等营养物质的吸收[27-28]，也能够提高鸡蛋中蛋白质含量[29]。而槲皮素对PEDV感染仔猪造成的脂质代谢功能障碍是否有缓解作用还未见报道。

本课题组前期通过蛋白质组学研究发现PEDV感染仔猪后差异表达蛋白(DEPs)参与的通路富集主要集中在氨基酸及其衍生物代谢和脂质代谢等。本试验结果显示，PEDV组仔猪脂质吸收代谢相关基因的表达量显著下调，说明病毒感染破坏了仔猪肠道的脂代谢通道，这与前期研究结果一致，而添加槲皮素缓解了因PEDV感染导致的仔猪空肠APOB、FABP2和FASN基因相对表达量的下调，促进了机体对脂肪的代谢和吸收，说明槲皮素对PEDV感染导致的脂代谢功能损伤有缓解作用。

4 结 论

槲皮素能够缓解仔猪因PEDV感染导致的肠道损伤，改善了小肠的吸收功能；缓解因PEDV感染造成的氧化损伤，提高了机体的抗氧化能力；缓解因PEDV感染导致的脂代谢功能损伤，促进机体对脂肪的吸收与代谢。