任 静，郝琴琴，成俊丽，朱芷葳，许冬梅，贾雪纯，李鹏飞

(山西农业大学生命科学学院，太谷 030801)

牛是单胎动物，每个发情周期内通常只有一个优势卵泡能够发育成熟，并最终排卵受精，其他卵泡则会在发育过程中走向闭锁[1]。发情周期内卵巢发育卵泡数量和质量直接关系到母牛的繁殖性能。前期研究发现，由下丘脑分泌的可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)是卵泡发育过程中的重要调节因子，对牛卵泡发育起负调控作用[2-3]。CART通过下丘脑-垂体-卵巢轴作用于卵巢中的卵泡颗粒细胞(granulesa cells,GCs)，促进GCs凋亡，最终导致卵泡闭锁[4]，但目前对影响CART表达的分子调控机制鲜见报道。

microRNA(miRNA)是一种由20个左右的核苷酸组成的小分子非编码RNA，能够与靶基因的部分或全部序列以碱基互补配对的方式相结合，导致mRNA降解并抑制其翻译。几乎所有编码mRNA产物的成熟序列都具有能够与miRNA结合的反应元件，表明miRNA在动物生理和病理过程中发挥着重要作用[5]。近年来大量研究表明，miRNA能够调控卵泡发育，Wright等[6]发现，miR-21能够抑制猪卵母细胞中程序性死亡因子PDCD4的表达进而影响卵母细胞的发育；在猪卵泡膜细胞中，miR-1275可通过抑制芳构化酶CYP19A1的表达来影响雌二醇(E2)分泌，促进GCs凋亡[7]。Zhang等[8]对多胎和单胎绵羊下丘脑中mRNA和miRNA差异谱进行分析，发现促甲状腺素释放激素、促性腺素释放激素和催乳素等与动物生殖相关的激素，以及能够调控这些激素表达的miRNA，如oar-miR-379-5p、oar-miR-152、oar-miR-432等均存在差异表达；进一步构建相应的下丘脑miRNA-mRNA调控网络发现，miRNA通过调控下丘脑中激素分泌影响卵泡发育，并对绵羊繁殖能力产生影响。以上结果表明，miRNA在不同动物体内的不同部位发挥作用，对卵泡发育相关激素合成及其分泌产生影响，进而调控卵泡发育。

本研究在明确bta-miR-377与CART 3′-UTR区靶向结合关系的基础上，进一步探究bta-miR-377对CART表达的调控作用。通过探讨bta-miR-377与牛CART 3′-UTR区的靶向作用关系及作用效果，明确牛下丘脑CART表达的上游调控机制，完善分子调控网络。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于山西文水县肉牛屠宰场选择3头正常发情的健康西门塔尔母牛，屠宰后采集下丘脑组织，用灭菌DPBS洗涤2次后投入液氮中速冻，带回实验室处理。

1.2 主要试剂和仪器

293T和PC12细胞均由山西农业大学生命科学学院实验室保存；pGP-miRGLO质粒购自Promega公司；miRNA茎环法第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TransIntroTMEL购自北京全式金生物技术股份有限公司。GloMax Multi酶标仪购自Promega公司；荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析 利用RNAhybrid软件预测并分析牛CART mRNA 3′-UTR区与bta-miR-377的结合情况及其二级结构，通过TargetScan数据库在线预测多个物种CART mRNA 3′-UTR区与bta-miR-377的结合位点；并对bta-miR-377与大鼠miR-377(rno-miR-377)进行序列相似性比对。

1.3.2 引物设计与合成 在NCBI中查询获得牛CART mRNA序列(GenBank登录号：NM_001007820)，在miRBase数据库中查询获得bta-miR-377、rno-miR-377-3p、rno-miR-377-5p成熟序列，根据牛CART mRNA基因组预测序列及bta-miR-377成熟序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.3 下丘脑组织总RNA提取及PCR扩增 利用Trizol法提取牛下丘脑组织总RNA并进行反转录，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。利用茎环法对bta-miR-377的表达进行分析，参照说明书配制反转录反应体系20 μL：2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，总RNA 4 μL，bta-miR-377 RT引物1 μL，RNase-free ddH2O 3.5 μL。反转录反应条件为：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min使酶失活。PCR反应体系20 μL：2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 4 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，退火1 min(温度见表1)，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。

表1 引物信息

1.3.4 重组质粒构建 根据bta-miR-377成熟序列的种子区域获取靶位点突变的插入序列，由上海吉玛公司合成野生型和突变型插入片段(图1)及bta-miR-377 mimics，用限制性内切酶XhoⅠ和SacⅠ切割目的片段和骨架载体pGP-miRGLO，将经过连接回收并纯化后的切割产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取经蓝白斑筛选并测序正确的菌落进行质粒抽提，野生型与突变型重组质粒分别命名为pGP-CART-WT和pGP-CART-Mut。

方框部分表示bta-miR-377对应的结合位点和突变位点

1.3.5 双荧光素酶报告载体试验 将构建好的双荧光素酶报告载体与bta-miR-377 mimics参照TransIntroTMEL的操作说明共转染293T细胞，培养30 h后裂解细胞，用双荧光素酶检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。

1.3.6 细胞培养及转染 选择处于对数生长期的PC12细胞，以5×105/孔的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到80%～90%后进行转染。用DMEM培养基分别稀释bta-miR-377 mimics、NC mimics和转染试剂，室温孵育5 min后再混合孵育20 min，加入6孔板中。将细胞在37 ℃、5% CO2条件下培养6 h后更换正常培养基，再培养48 h。

1.3.7 牛CART基因实时荧光定量PCR反应 提取上述PC12细胞中的总RNA，参照1.3.3中方法对转染bta-miR-377 mimics的试验组及转染NC mimics的阴性对照组中的bta-miR-377进行特异性扩增，检测bta-miR-377的表达情况，对转染效果进行判断。通过实时荧光定量PCR对试验组及对照组中牛CART基因的表达量进行检测，并以β-actin作为内参基因，引物信息见表1。PCR反应体系10 μL：2×TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算CART mRNA在PC12细胞中的相对表达量。

1.3.8 Western blotting检测CART蛋白表达 将bta-miR-377 mimics、NC mimics分别与CART过表达载体共转染293T细胞后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量后取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶10%，浓缩胶5%)、转膜、室温下封闭后，加入CART抗体(1∶500稀释)过夜孵育，加入山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀释)摇床孵育1 h；滴加化学发光液后进行显影并采集图像，利用Image J对图像进行分析，计算CART蛋白相对表达量。

1.3.9 数据统计及分析 每个试验均设置3个重复组，结果采用平均值±标准误表示，对双荧光素酶报告基因试验结果进行单因素方差分析，对实时荧光定量PCR结果进行独立样本t检验，并利用GraphPad Prism 9.0软件绘制直方图。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 牛CART与bta-miR-377靶向结合位点预测及二级结构预测

经TargetScan数据库预测确定bta-miR-377能够靶向结合牛CART 3′-UTR区，结合位点在161―167 bp区域，信噪比为-0.42(图2)，表示结合性较强；进一步分析发现，在包括大鼠在内的多种哺乳动物中，bta-miR-377与CART 3′-UTR区的结合位点高度保守，序列为UGUGUGAA。

图2 bta-miR-377与CART 3′-UTR结合位点及信噪比

利用RNAhybrid软件进一步预测二者结合的二级结构，结果显示，bta-miR-377的种子序列2～8 nt与牛CART 3′-UTR区完全互补配对，位于5′-端的首个核苷酸所对应的靶基因的核苷酸为A，且结合位点最小自由能为-90 kJ/mol(图3)，符合靶位点预测条件。

图3 bta-miR-377与牛CART 3′-UTR结合的二级结构

2.2 bta-miR-377与rno-miR-377序列相似性比对

bta-miR-377与rno-miR-377序列比对结果显示，miR-377在牛与大鼠中的种子区序列不一致，保守性较低，表明PC12细胞中内源的rno-miR-377不会影响bta-miR-377与CART 3′-UTR的结合，对后续试验结果无影响，故在本研究的细胞转染过程中不必设计inhibitor组。

2.3 牛下丘脑bta-miR-377与CART基因内源性表达分析

以牛下丘脑cDNA为模板，PCR扩增结果显示，bta-miR-377经茎环法特异性扩增后产物条带约为70 bp(图4A)，CART基因PCR扩增产物条带约为728 bp(图4B)，均与预期结果相符。

M，DNA Marker；1～3，目的产物

2.4 双荧光素酶报告基因验证靶标关系

分别共转染bta-miR-377 mimics与重组质粒及空质粒，并设置NC mimics作为阴性对照组。结果显示，转染空白质粒时bta-miR-377 mimics和NC mimics两组间荧光活性无明显差异(图5)，表明试验体系稳定，结果可靠。bta-miR-377 mimics+pGP-CART-WT共转染的相对荧光素酶活性与NCmimics+pGP-CART-WT相比差异极显著(P<0.01)，而pGP-CART-Mut与bta-miR-377共转染时，其相对荧光素酶活性与对照组无显著差异(P>0.05)。表明bta-miR-377在CART基因3′-UTR区存在结合位点，CART是bta-miR-377的靶基因。

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。下同

2.5 转染后PC12细胞中bta-miR-377与CART的表达分析

PC12细胞转染后，收集细胞提取总RNA，对bta-miR-377 mRNA的表达量进行检测，结果显示，bta-miR-377 mRNA在试验组中高表达，在对照组中无表达(图6A)，与预期结果一致，说明细胞转染成功。转染bta-miR-377 mimics后的试验组与转染NC mimics的对照组相比，试验组PC12细胞中CART基因mRNA表达量极显著降低(P<0.01，图6B)，表明bta-miR-377能够抑制神经元细胞内源CART基因mRNA的表达。

M,DNA Marker；1～3，试验组PCR产物；4～6，对照组PCR产物

2.6 bta-miR-377对293T细胞中CART蛋白表达的影响

Western blotting检测结果显示，与NC mimics相比，转染bta-miR-377 mimics的293T细胞中的CART蛋白表达量显著降低(P<0.05，图7)，表明bta-miR-377能够在蛋白水平抑制CART的表达。

A，Western blotting检测结果；B，Image J灰度分析结果

3 讨 论

miRNA是一类在进化上较为保守的内源性非编码RNA，一般由18～25个核苷酸组成，能够与靶基因mRNA的3′-UTR区、5′-UTR区或CDS区结合调控目的基因表达。miRNA的调控机制可分为两类：与靶基因mRNA完全互补配对导致其降解，在转录后水平抑制表达；或与mRNA不完全互补配对直接抑制其翻译，在翻译水平抑制表达。目前对miRNA的研究主要集中在各类癌细胞的成因、扩散及靶向药物研发等方面[9-11]。miR-377是近年来发现的一种重要的miRNA分子，对多种癌细胞生长具有抑制作用[12-14]，miR-377还能够通过调控与血管生成相关因子VEGF的生成抑制大鼠缺血性脑损伤[15]；抑制miR-377表达可以减少由于药物引起的心肌细胞凋亡[16]。在调控动物卵泡发育方面，Zhang等[17]证实oar-miR-377和oar-miR-485-3p可与绵羊卵巢中的PTX3靶向结合，降低PTX3表达量，影响卵母细胞的质量。本研究发现，bta-miR-377与CART在牛下丘脑组织中均有表达，经生物信息学手段和双荧光素酶报告基因法明确二者靶向结合关系后，认为bta-miR-377能够在牛下丘脑中与CART基因mRNA的3′-UTR区靶向结合，影响CART的表达。

动物卵泡在生长发育过程中所需的营养物质主要由包裹在其外周的GCs提供，GCs的凋亡是卵泡闭锁的一个重要表现[18]。下丘脑分泌的各类神经肽能够通过调控垂体中促性腺素分泌[19]、卵泡GCs增殖凋亡[20]、E2分泌[21-22]等过程调控动物卵泡发育。前期研究发现，CART在牛优势卵泡中的含量低于从属卵泡[3]；一定条件下体外培养牛卵泡GCs，在培养液中添加CART后会对GCs的生长和增殖产生影响，导致E2分泌被抑制[23-24]。经进一步高通量测序及免疫组化定位分析发现，CART基因mRNA及其多肽在不同发育阶段牛卵泡GCs中表达量有显著差异，在卵泡发育波出现偏差后，高表达的CART将抑制优势卵泡继续发育，因此认为CART对牛卵泡生长发育具有负调控作用[25]。近年来，为明确CART影响卵泡发育的作用机理，本课题组一直致力于筛选并鉴定位于牛卵泡GCs膜上的能够与CART特异性结合并发挥调控作用的G蛋白偶联受体[26-27]，而对牛下丘脑中CART表达的分子调控机制研究较少。

CART大量存在于哺乳动物的下丘脑神经核，能够通过下丘脑-垂体-卵巢轴直接作用于卵巢GCs，因此，本研究选择PC12细胞株作为细胞模型，该细胞株能够在神经生长因子的诱导下发生形态及生理功能的变化[28]，形成具有内分泌功能的神经胶质细胞，且具有易培养、易转染等特点，因此常应用于如帕金森病、阿尔兹海默症等神经元损伤或神经系统疾病等方面的研究中[29]。目前，PC12细胞在对神经分泌性物质的研究中应用广泛，脑源性神经营养因子(BDNF)是一种抑郁症标志物，Zhang等[30]通过制备RNA依赖的腺嘌呤核苷脱氨酶1(ADAR1)过表达的PC12细胞株，发现ADAR1能够通过调控miR-432转录显著降低BDNF mRNA的表达丰度发挥抗抑郁作用；Zosen等[31]对PC12细胞进行体外培养，证实了细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)对其多巴胺分泌的抑制作用。而CART作为一种已经证实的神经肽，被检测到在PC12细胞中高表达[32]，本研究中生物信息学分析结果显示，bta-miR-377与rno-miR-377之间的保守性较低，且bta-miR-377与牛和大鼠CART基因3′-UTR区的结合位点序列相同，表明PC12细胞内源的rno-miR-377不会影响bta-miR-377与大鼠CART基因3′-UTR区的结合，因此本研究选择PC12细胞作为模式细胞是合理的，通过转染miRNA mimics使bta-miR-377在PC12细胞中过表达，结果显示PC12细胞中CART的表达被极显著抑制，这与Western blotting检测bta-miR-377对CART蛋白表达影响的试验结果一致，表明bta-miR-377能够在基因和蛋白水平抑制CART的表达，是CART表达过程中的负调控因子，这将为深入探究CART在神经元细胞中表达的分子调控机制奠定基础。

4 结 论

在牛下丘脑中检测到bta-miR-377与CART基因均有表达，bta-miR-377与CART基因3′-UTR区能够靶向结合，经细胞功能验证明确转染bta-miR-377 mimics能够抑制CART基因mRNA和蛋白表达，推测bta-miR-377能够与CART基因3′-UTR区结合进而影响CART基因mRNA转录。