商海军，蒋丽君，江本利，姚晓华，闫晓明*，於春*

（1.安徽省农业科学院棉花研究所，安徽 合肥 230031；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601；3.青海省农林科学院，青海 西宁 810016）

藜麦属于藜科，产自安第斯山脉，有7 000年左右的历史，是当地的主要食物来源，被称为粮食之母[1]。藜麦相比其它谷物，营养更加均衡丰富，富含蛋白质、矿物质、脂肪酸和维生素等[2-3]。此外，藜麦还含有黄酮、皂苷和多酚等生物活性物质，具有抗氧化和抗癌等多种药理作用，被联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO） 认定为一种“全营养食品”[4]。为了在世界上推广藜麦，联合国将2013年设定为国际藜麦年，藜麦被越来越多的消费者了解，藜麦的产品也得到越来越多的欢迎和支持。近些年，藜麦在中国的青海、新疆、山西和宁夏开始被种植，藜麦也因此走上了中国人的餐桌。

藜麦蛋白主要分布在藜麦的胚、胚乳以及种皮里，含量为14%左右[5]，并且藜麦蛋白也是一种含有大量赖氨酸和组氨酸的优质蛋白质[6]，高于水稻、大麦和玉米等大多数谷类，和小麦蛋白含量相当[7]，是一种很好的植物蛋白来源。目前科学家对于藜麦的研究主要集中在它的籽实部位，只有少量关于藜麦秸秆的发酵可以改善其作为饲料价值的研究，绝大多数秸秆在收割时会被遗弃。与其他作物的秸秆相比，藜麦秸秆含有丰富的粗蛋白质，含量为10.14%～13.14%[8]，但目前对于藜麦秸秆蛋白的结构与功能性质鲜见报道。因此为了进一步开发藜麦植株潜在的营养和应用价值，本文研究和分析藜麦秸秆蛋白质的结构特性及pH值和温度对其功能性质的影响，以期望可以开发出具有适当功能特性的植物蛋白，来解决藜麦收割后的秸秆处理问题以及为藜麦秸秆蛋白的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦秸秆（青藜2号）：青海省农科院藜麦种植基地栽培，粒色白色，株高170 cm，2019年4月中下旬以覆膜穴播方式播种，2019年10月收获，秸秆经晾晒至水分为10%～12%，无腐败现象；蛋白Maker：北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶（50 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；聚丙烯酰胺、四甲基乙二胺、Tris/HCl缓冲液、过硫酸铵、β-巯基乙醇、5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）[5，5′-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]：合肥拜尔迪生物技术有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CT15RT台式高速冷冻离心机：上海天美科学仪器有限公司；ALPHA1-2LD冷冻干燥机：德国CHRIST公司；IR Prestige型傅里叶红外光谱仪：日本岛津公司；VELP-UDK159全自动凯氏定氮仪：北京金洋万达科技有限公司；DSC8000差示量热扫描仪：美国Perkin Elmer公司；DYY-4C型高压双稳电泳仪：北京六一生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 藜麦秸秆蛋白的制备

1.3.1.1 提取流程

参照许新月等[9]的方法提取藜麦秸秆蛋白。提取流程：藜麦秸秆→加入3倍水→打浆1min→超声30min→过滤→调节pH值至5→加纤维素酶→酶解8 h→灭酶→5 000 r/min离心20 min→真空冷冻干燥→产物干粉。

1.3.1.2 藜麦秸秆蛋白纯度的测定

藜麦秸秆蛋白的含量采用凯氏定氮法进行测定，藜麦秸秆蛋白纯度按下列公式计算。

式中：P为藜麦秸秆蛋白的纯度，%；m为产物干粉中藜麦秸秆蛋白的质量，g；M为产物干粉质量，g。

1.3.2 藜麦秸秆蛋白的结构测定

1.3.2.1 藜麦秸秆蛋白分子量测定

参照张越[10]的方法，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）测定藜麦秸秆蛋白质分子量。测定条件：配制12%的分离胶、5%的浓缩胶；上样15 μL；浓缩胶电压120 V，分离胶电压200 V；常温（25℃左右）固定胶板、染色、脱色。

1.3.2.2 藜麦秸秆蛋白的热学特性

参照邱月[11]的方法，使用差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）测定藜麦秸秆蛋白的热学特性。将2 mg藜麦秸秆蛋白粉在铝盒中均匀铺平，密封压片，放入DSC仪器中进行检测，对照组为密封的空铝盒，加热速率为10℃/min，样品温度范围为30℃～150℃。

1.3.2.3 藜麦秸秆蛋白巯基和二硫键含量的测定

参照王洪伟等[12]方法对藜麦秸秆蛋白巯基和二硫键含量进行测定。游离巯基含量：向0.5 mL 10 mg/mL藜麦秸秆蛋白样品中加入0.02 mL 4 mg/mL DTNB和2.5 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），25℃条件下反应25 min后，在412 nm波长下测定其吸光度值。总巯基含量：向0.2 mL 10 mg/mL藜麦秸秆蛋白样品中加入0.02 mLβ-巯基乙醇和1.0 mL 10 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制），混匀后在25℃条件下反应1 h，然后量取10 mL 12%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）加到样品中，25℃继续反应1 h后，在5 000 r/min条件下离心10 min，用12%TCA溶液洗涤离心所得沉淀物两次，然后将洗涤后的沉淀物用3.0 mL 8 mol/L尿素溶液（以Tris-Gly配制）溶解，再继续添加0.04 mL DTNB，25℃条件下反应25 min，最后在412 nm波长下测其吸光度值。空白试验均用Tris-HCl，平行测定3次。按下列公式进行计算。

式中：1.36×104为 Elman 的摩尔消光系数；A412为412 nm波长处测得的吸光度值；C为藜麦秸秆蛋白样品的浓度，mg/mL；D 为稀释因子（D1为6.04、D2为15）。

1.3.2.4 藜麦秸秆蛋白二级结构的测定

参照魏君慧等[13]的方法。称取1 mg藜麦秸秆蛋白粉，与100 mg KBr粉末混合，压制成薄片。以KBr为背景，在4 000 cm-1～400 cm-1波数下对藜麦秸秆蛋白进行红外光谱分析，扫描次数为64次。

1.3.3 藜麦秸秆蛋白功能性测定

1.3.3.1 藜麦秸秆蛋白溶解度

参照Wu等[14]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL藜麦秸秆蛋白溶液，在一定温度和pH值条件下水浴搅拌1 h，离心 10 min（4 000 r/min），测定上清液中蛋白质的含量。考察不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白溶解度的影响：设定温度为 30、40、50、60、70 ℃；pH 值为 3、5、7、9、11。溶解度按下列公式计算。

1.3.3.2 藜麦秸秆蛋白吸水性

参照张艳荣等[15]的方法。取20 mL 10.0 mg/mL的藜麦秸秆蛋白溶液，在一定温度和pH值条件下水浴搅拌 1 h，离心 10 min（4 000 r/min），弃去上清液，测量残留物质的质量。考察不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白吸水性的影响：设定温度为 30、40、50、60、70 ℃；pH 值为 3、5、7、9、11。吸水性按下列公式计算。

1.3.3.3 藜麦秸秆蛋白起泡性

参照郑文彬等[16]的方法。取50 mL 10.0 mg/mL的藜麦秸秆蛋白溶液，在一定温度和pH值条件下高速搅拌20 min，用量筒测量泡沫体积及液体体积。考察不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白的起泡性的影响：设定温度为 30、40、50、60、70 ℃；pH 值为 3、5、7、9、11。起泡性按下列公式计算。

1.3.4 数据处理

利用Excel和Origin 8.5软件对试验过程中测定的数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 藜麦秸秆蛋白的纯度

通过凯氏定氮法对提取得到的藜麦秸秆蛋白粉中的蛋白质含量进行测定，得到藜麦秸秆蛋白纯度为80.55%，其纯度高于王棐等[17]提取的藜麦蛋白纯度（78.30%）和Aluko等[18]提取的藜麦蛋白纯度（65.52%）。

2.2 藜麦秸秆蛋白结构特性

2.2.1 藜麦秸秆蛋白分子量测定结果

藜麦秸秆蛋白的SDS电泳图谱见图1。

图1 藜麦秸秆蛋白的SDS电泳图谱Fig.1 SDS electrophoresis pattern of quinoa straw protein

由图1中可以看出，藜麦秸秆蛋白在66.4 ku～97.2 ku、29.0 ku～44.3 ku、20.1 ku～29.0 ku、14.3 ku～20.1 ku以及小于14.3 ku范围内有条带，其29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku条带染色程度较深，表明该分子质量范围内的蛋白含量较高，因此可以说明藜麦秸秆蛋白中中低分子量的蛋白质占多数。

球蛋白和白蛋白是藜麦蛋白的两种主要蛋白质，它们具有特殊的二级结构，其亚基之间的相互作用影响着蛋白质的结构和理化学性质[19]。11S球蛋白，是许多双子叶植物家族的主要成分，分子量范围在20 ku～22 ku和33 ku～36 ku附近[20]，所以图1中分子量在29.0 ku～44.3 ku和20.1 ku～29.0 ku范围内的条带可能为11S球蛋白。2S白蛋白是第二丰富的蛋白质，对应的分子量小于20 ku[21]，图1中分子量为14.3 ku～20.1 ku和小于14.3 ku范围内的条带可能为2S白蛋白。

2.2.2 藜麦秸秆蛋白热学特性结果分析

藜麦秸秆蛋白的DSC曲线见图2。

图2 藜麦秸秆蛋白的DSC曲线Fig.2 DSC curve of quinoa straw protein

在DSC曲线上若有吸热峰，则该吸收峰区域为变性温度范围，吸收峰的峰值所对应的温度是该样品的热变性温度[22]。由图2可以看出，藜麦秸秆蛋白出现了一次吸收峰，说明发生了一次变性。藜麦秸秆蛋白的变性温度较高，起始变性温度为131.06℃，峰值变性温度为132.72℃，终止变性温度为134.51℃。变性热焓的大小还可以作为蛋白变性程度的依据，热焓越大，表明变性越小[23-24]，藜麦秸秆蛋白的焓变为7.82 J/g，而Abugoch等[25]研究发现藜麦蛋白的变性热焓为12.40 J/g，变性温度为98.1℃，可以看出藜麦秸秆蛋白的热稳定性更好，变性程度更大。

2.2.3 藜麦秸秆蛋白巯基和二硫键含量的分析

二硫键通常能与同样具有很高化学活性的巯基之间发生相互转化，从而共同影响着蛋白质结构的稳定及其功能性质。所以，测定蛋白质中的巯基和二硫键含量，在分析研究蛋白质分子的空间结构和功能性质之间的关系尤为重要[26]。藜麦秸秆蛋白的巯基键和二硫键含量见图3。

图3 藜麦秸秆蛋白的巯基键和二硫键含量Fig.3 The sulfhydryl bond and disulfide bond content of quinoa straw protein

从图3可以看出，藜麦秸秆蛋白中游离巯基含量为 10.21 μmol/g，二硫键含量为 23.57 μmol/g。与一般植物蛋白相比，例如杏鲍菇分离蛋白的游离巯基和二硫键含量分别为 40.75 μmol/g 和 10.39 μmol/g[13]，核桃蛋白游离巯基和二硫键含量分别为8.45 μmol/g和5.20 μmol/g[27]，藜麦秸秆蛋白的二硫键含量更高。在蛋白质分子中，二硫键含量影响着蛋白质的空间结构及功能性质，二硫键含量高的蛋白质更有利于形成网络结构[28]。Kinsella[29]研究发现含有二硫键的蛋白具有较高的热稳定性，这也是藜麦秸秆蛋白的热焓和变性温度较高的原因。

2.2.4 藜麦秸秆蛋白傅里叶红外结果分析

一般情况下，蛋白质和多肽在红外区都有着若干特征吸收谱带，如酰胺I带（1 700 cm-1～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ带（1 550 cm-1～1 530 cm-1）和酰胺Ⅲ带（1 300 cm-1～1 260 cm-1）[30]。其中，酰胺I带最常用于蛋白质二级结构的分析，反映α-螺旋（1 660 cm-1～1 650 cm-1）、β-折叠（1 640 cm-1～1 600 cm-1）、β-转角（1 700 cm-1～1 660 cm-1）及无规则卷曲（1650cm-1～1640cm-1）等不同结构信息[31]。通过对藜麦秸秆蛋白酰胺I带（1 700 cm-1～1 600 cm-1）的图谱去卷积、基线校准、二阶导数拟合后进行分峰拟合得到图4。

图4 藜麦秸秆蛋白在酰胺I带的分峰拟合图Fig.4 Peak fitting diagram of quinoa straw protein in the amide I band

由图4可知，分峰拟合后共获得8个单一峰，计算各子峰的面积，得出相对应结构所占比例，结果如表1所示。

表1 藜麦秸秆蛋白的二级结构的含量Table 1 The content of secondary structure of quinoa straw protein

由表1可知，藜麦秸秆蛋白的二级结构以β-转角为主，含量为36.42%，β-转角可以促进蛋白质生成球状结构；α-螺旋和β-折叠含量相当，分别为25.19%和25.91%，β-折叠含量高也可以进一步说明藜麦秸秆蛋白的变性温度较高；而无规则卷曲含量最低，为12.48%。因为β-转角在藜麦秸秆蛋白二级结构中含量最高，所以藜麦秸秆蛋白的功能性质很可能大部分取决于β-转角，其它的二级结构也同样影响着其功能性质。

2.3 藜麦秸秆蛋白的功能性质

2.3.1 藜麦秸秆蛋白的溶解度

蛋白质的溶解度可以作为评价食品品质和稳定性的主要指标之一，它对蛋白的吸水性、起泡性等都会产生一定的影响。不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白溶解度的影响见图5。

图5 不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白溶解度的影响Fig.5 Effect of different temperatures and pH on the protein solubility of quinoa straw

从图5a可以看出，蛋白质的溶解度在30℃～60℃不断上升，当温度达到60℃时，溶解度达到最高，为53.61%，但是随着温度继续升高，蛋白质溶解度在不断减小。这是因为适宜的温度可以促进蛋白质的溶解，然而当温度过高时，会导致蛋白质发生变性，进而导致溶解度的降低[32]。从图5b可以看出，当pH值在3～5时，溶解度不断减小，因为pH值接近等电点时，溶解度最小。当pH值大于5时，溶解度不断增加，在pH值为9时，蛋白质溶解度达到最大，为46.37%。这是因为在碱性pH值条件下，氨基的脱质子和羧基的电离导致带负电荷的物质变多，蛋白质与溶剂的相互作用得到改善，使蛋白质的溶解度增加，但是随着碱性继续增强，导致蛋白质变性，溶解度下降[33]。因此，藜麦秸秆蛋白更适合在中性或弱碱性的条件下使用。藜麦蛋白最高溶解度为63.68%，藜麦秸秆蛋白的最高溶解度比藜麦蛋白低，但是在pH值为3时，藜麦秸秆蛋白的溶解度（36.35%）比王棐等[17]研究的藜麦蛋白的溶解度（约20%）、大豆蛋白溶解度（约10%）和豌豆蛋白溶解度（约5%）都高，这也为藜麦秸秆蛋白其它的功能性质研究提供基础。

2.3.2 藜麦秸秆蛋白的吸水性

蛋白质的吸水性表示蛋白质结合水分子的能力，是蛋白质的重要功能性质，对于研究食品的质地、水分含量以及口感有重要作用。不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白吸水性的影响见图6。

图6 不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白吸水性的影响Fig.6 Effect of different temperatures and pH values on the water absorption of quinoa straw protein

由图6a可知，温度在30℃～60℃时，藜麦秸秆蛋白的吸水性呈上升趋势，在60℃吸水性达到最大，为3.11 g/g，随着温度的进一步升高，吸水性降低。这是因为温度低于变性温度时，蛋白质会发生伸展，有一部分亲水基团可能会和水结合，然而温度过高，蛋白变性，暴露许多非极性基团，减弱了与水的作用，导致吸水性降低[15]。由图6b可以看出，蛋白质的吸水性随着pH值的升高呈先降低后增加再降低的趋势，在pH值为9的时候，蛋白吸水性最高为3.34 g/g。这是因为pH值接近蛋白质等电点，蛋白质-水分子间结合的能力最弱，随着pH值的升高，偏离等电点，蛋白质的吸水能力随之增强[34]。但是碱性继续增强，蛋白会发生变性，所以吸水性变弱，该现象进一步说明了pH值对蛋白的吸水性有较大影响。另外，藜麦秸秆蛋白的吸水性比何兴芬[35]研究的藜麦蛋白最大持水性1.62 g/g要高，所以藜麦秸秆蛋白在食品品质研究上具有重要价值。

2.3.3 藜麦秸秆蛋白的起泡性

不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白起泡性的影响见图7。

图7 不同温度和pH值对藜麦秸秆蛋白起泡性的影响Fig.7 Effect of different temperatures and pH values on the foaming ability of quinoa straw protein

由图7a可以看出，蛋白质的起泡性随着温度的升高呈上升趋势，在60℃条件下，蛋白起泡性最高为40.24%。这是因为温度适当地提高，可以增大蛋白的溶解度，使可溶性蛋白含量增加。又由于泡沫的形成与可溶性蛋白含量有关，所以促进了起泡性的增加[36]。但是随温度继续升高，蛋白发生变性，进而起泡性降低。由图7b可以看出，藜麦秸秆蛋白质的起泡性在pH值为9时最高（40.86%）；pH值为5时最低（26.36%）。这是因为pH值为5时，溶解度较低，可溶性蛋白含量少，形成泡沫较少[36-37]。随着溶液pH值呈碱性，藜麦秸秆蛋白里的净电荷在不断增加，疏水作用力减小，蛋白质扩散到溶液界面的速度加快，产生大量泡沫[38]，所以藜麦秸秆蛋白起泡性增加。

3 结论

本文研究了藜麦秸秆蛋白的结构特性和功能性质，发现藜麦秸秆蛋白以中低分子量的蛋白居多，分子量主要分布在29.0 ku～44.3 ku和小于14.3 ku的范围内。藜麦秸秆蛋白变性温度为132.72℃，有着较好的热稳定性，其巯基和二硫键含量较高，这也是藜麦秸秆蛋白热焓和变性温度较高的一个原因。红外光谱分析藜麦秸秆蛋白的β-转角相对占比最高，α-螺旋和β-折叠相当，无规则卷曲占比最低。另外，温度为60℃时和pH值为9时，藜麦秸秆蛋白的溶解度、吸水性和起泡性最好，说明温度和pH值对藜麦秸秆蛋白的溶解度、吸水性和起泡性等功能性质影响较大，因此研究蛋白性质时要注意控制这些影响因素。本研究为藜麦秸秆蛋白的产品研究和开发提供参考。