王印壮，李素萍，段定定，马艳莉，*，牟建楼，罗建成，于海彦，刘亚琼，孙剑锋

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；2.南阳理工学院，河南 南阳 473004）

红谷（Panicum miliaceum L.）又称红小米，属于北方小米的一种，是禾本科狗尾草属一年生草本植物红粟的种子。研究表明其营养物质丰富多样、比例协调、蛋白质含量较高，必需氨基酸与非必需氨基酸、总氨基酸的比值分别为69.69%、41.07%，接近世卫组织理想模式，并且其性温味甘，具有消食暖胃、抗氧化、抗动脉粥样硬化以及益气健脾等功效[1-3]。随着人们健康意识的提高，具有保健功效的小米黄酒逐渐成为研究热点。其可以保留发酵产生的各种有益成分，如氨基酸、活性多肽、糖类、维生素以及各种微量元素等，与其它酒类相比，营养价值丰富[4]。李杰等[3]采用均匀设计试验以及反向传播神经网络方法，优化富含γ-氨基丁酸的红小米黄酒的酿造工艺，研究表明在麦曲10.35%、酿酒曲0.42%、24℃前酵6 d、14℃后酵70 d条件下，γ-氨基丁酸可达0.139 8 mg/mL。李安等[5]利用响应面试验法对小米黄酒酿造的最佳工艺条件进行优化，最终确定了最佳的浸米条件、糖化条件以及发酵工艺条件。

目前，红谷在新型黄酒酿造中的研究多集中在其化学成分、酿造特性、发酵工艺优化和抗氧化等方面。陈林玉等[1]通过结晶沉淀纯化结合硅胶色谱层析等分析方法，对红谷的化学成分进行检测，发现了其独特的营养价值。Li等[2]通过对比红谷与其它5种酿酒原料在浸泡和蒸煮过程中理化和结构特性的不同，发现红谷的蛋白质和脂肪含量最突出，浸米浆总酸和氨基酸态氮含量最高，蒸煮过程中颗粒形态转变为膨胀的多孔结构，表明红谷适合黄酒的酿造；李杰等[6]以红谷为原料制备黄酒，通过Box-Behnken试验结合均匀设计试验优化发酵工艺，得出的最佳酿造工艺生产的黄酒具有较强抗氧化活性。但是，目前对于红谷黄酒在发酵过程中品质的变化规律鲜有研究。因此，为了更好地指导红谷黄酒的工业化生产，监测其发酵过程中的品质变化规律具有重要意义，通过测定红谷黄酒在发酵过程中理化指标及代谢产物的变化，可反映出其品质在发酵过程中的变化规律[7]。

本文通过研究红谷黄酒在发酵过程中理化特性（还原糖、酒精度、pH值、总酸、氨基酸态氮、可溶性固形物）、色值以及主要物质的变化规律，分析发酵过程对红谷黄酒品质的影响，以期为其品质的提升以及进一步开发具有针对性的新型功能红谷黄酒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红谷黄酒发酵液：2020年12月取自河南南阳某黄酒企业生产车间；γ-氨基丁酸、芦丁（均为色谱纯）：上海源叶试剂有限公司；没食子酸、儿茶素、香草酸、阿魏酸、愈创木酚、苯甲酸、水杨酸、槲皮素（均为色谱纯）：美国Sigma公司；福林酚、异硫氰酸苯酯（均为色谱纯）：上海麦克林试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪、液相色谱柱Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国 Agilent仪器有限公司；CR-400色差计：日本柯尼卡美能达公司；UV-752N紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；5424R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海虹益仪器有限公司；RE-52CS旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 红谷黄酒样品采集与前处理

红谷黄酒以红谷（经清洗、浸泡、蒸煮）、生麦曲、熟麦曲、酒母及清水为原料，大罐发酵30 d，前酵阶段7 d，投料落罐发酵一段时间（4 h～8 h）后，以无菌压缩空气进行通气开耙，发酵温度控制在28℃左右；后酵阶段23 d，采用低温发酵，温度控制在18℃左右。分别取发酵过程中1（投料落罐结束后开始发酵的第1天）、2、3、4、5、6、7、10、20、30 d 的红谷黄酒发酵液，每个样品平行取3次，在7 000 r/min下离心15 min后，取上清液即为待测样品。

1.3.2 理化特性的测定

1.3.2.1 还原糖、可溶性固形物含量的测定

参照赵凯等[8]的3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量；可溶性固形物含量采用折光仪在25℃下测定，以°Brix表示。

1.3.2.2 酒精度的测定

酒精度参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的方法测定。

1.3.2.3 总酸、pH值、氨基酸态氮含量的测定

总酸、pH值、氨基酸态氮含量参照GB/T 13662—2018《黄酒》中的方法测定。

1.3.3 色值

利用色差计及CIELab颜色空间分析样品颜色变化[9]，其中L*反映样品明亮度，正值偏亮，负值偏暗；a*描述红色到绿色的变化，正值偏红，负值偏绿；b*描述黄色到蓝色的变化，正值偏黄，负值偏蓝；总色差（ΔE）表示与发酵第1天样品相比的颜色总差别，计算公式如下。

样品的色度（color index，CI）为 A420、A520和 A620之和，色调（Hue）为A420与A520的比值。色调反映样品颜色的变化情况，数值越高，样品偏黄、橙色，数值越低，样品偏红色，而色度则会对色调产生影响，均可反映样品在发酵过程中色泽的变化。

1.3.4 总酚、总黄酮含量测定

采用Folin-Phenol法测定总酚含量[10]，其标准曲线回归方程为y=1.054 4x-0.004 5，相关系数为R2=0.995 8；采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定总黄酮含量[11]，其标准曲线回归方程为y=0.001 1x-0.001 9，相关系数为R2=0.998 9。

1.3.5 酚类组成及含量测定

样品前处理：将20 mL待测样品与20 mL乙酸乙酯混匀，萃取3次，回收后的上清液置于50℃旋转蒸发器中蒸发至干，然后复溶于4 mL甲醇溶液中，过0.45 μm滤膜，待高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析[12]。

色谱检测条件参考侯丽娟等[13]的方法稍作修改。色谱柱 Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A：2%乙酸溶液；流动相 B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；采用梯度洗脱（0～5 min，3%B～10%B；5 min～15 min，10%B～15%B；15 min～25 min，15%B～25%B；25 min～35 min，25%B～30%B；35 min～40 min，30%B～3%B）。各酚类物质的线性方程及相关系数见表1。

表1 各酚类物质的线性方程和相关系数Table 1 Linear equations and correlation coefficients of phenols

1.3.6 γ-氨基丁酸含量测定

γ-氨基丁酸含量参照QB/T 4356—2012《黄酒中游离氨基酸的测定高效液相色谱法》测定，其标准方程为y=28.484 59x-16.810 73，相关系数为R2=0.998 4。

1.4 数据处理与分析

数据用平均值±标准差表示，利用IBM SPSS Statistics 26.0对数据进行单因素方差分析（P＜0.05）以及最小显著差数法、邓肯多重比较分析，利用软件Origin 2019绘图。

2 结果与分析

2.1 红谷黄酒发酵过程中理化性质的变化规律

2.1.1 还原糖含量与酒精度的变化规律

黄酒发酵过程中，还原糖和酒精度是最基本和最具有代表性的理化指标，同时也是黄酒香气成分形成的重要因素[14]。红谷黄酒发酵过程中还原糖与酒精度的变化见图1。

图1 红谷黄酒发酵过程中还原糖与酒精度的变化Fig.1 Changes of reducing sugar and alcohol content during red millet Huangjiu fermentation

由图1所示，红谷黄酒在发酵过程中还原糖含量呈先急剧下降后逐渐稳定的趋势。在前期研究中发现，红谷中支链淀粉占总淀粉的96.39%[2]，因此导致其吸水性强，蒸煮后易糊化，且蒸煮后柔软的质构和疏松的孔状微观结构，有利于作为糖化发酵剂的生、熟麦曲所带入的霉菌以及糖化酶、蛋白酶等酶类作用于红谷，而产生大量的还原糖、氨基酸等丰富的碳、氮源。前酵阶段（发酵前7 d）还原糖、酒精度变化较快，这是由于发酵前期营养物质丰富，同时落料后会以无菌压缩空气进行开耙通气，使得酿造体系均匀度、发酵液的溶氧量增加，酵母等微生物生长代谢加快，将还原糖转化成乙醇等物质，这些物质与后期风味形成有关[15]。后酵阶段（8 d～30 d）后期，还原糖含量逐渐稳定在5.93 g/L左右，而酒精度略微降低，这是由于后酵阶段温度较低且糖含量减少等因素抑制了酵母菌代谢，且乙醇也可与酸类物质发生酯化反应生成酯类物质。发酵第20天时，酒精度达到最大值为15.55%vol。

2.1.2 总酸含量与pH值的变化规律

黄酒发酵过程中，总酸和pH值的变化能反映出发酵过程是否正常，且二者可直接影响黄酒风味[16]。红谷黄酒发酵过程中总酸与pH值的变化见图2。

图2 红谷黄酒发酵过程中总酸与pH值的变化Fig.2 Changes of total acid and pH during red millet Huangjiu fermentation

由图2可知，总酸含量呈先上升后下降再上升的趋势，pH值的变化则与之相反。发酵第1天时，样品中总酸为3.54 g/L，且pH值小于4，这是由于落料前红谷经浸泡得到的米浆水中的酸类物质通过蒸米饭带入发酵液中，使发酵环境呈弱酸性，从而抑制杂菌的生长，创造发酵液中酵母菌适合的发酵环境，保证发酵正常[17]。发酵前3 d的总酸显著上升（P＜0.05）、pH值显著下降（P＜0.05），这主要与糖化发酵剂中的产酸微生物代谢旺盛有关，随后pH值及总酸含量均出现波动现象，这可能是发酵前期乙醇含量的快速增加，积累的高浓度乙醇导致部分菌体自溶所致；后酵阶段（8 d～30 d），pH值逐渐降低、总酸逐渐升高，这是因为后酵阶段主要是麦曲带入的乳酸菌和醋酸菌主导发酵过程，发酵液中乳酸和乙酸的含量逐渐增加所致，后续研究也表明乳酸和乙酸在后酵阶段含量分别增加了1.48倍和1.44倍。这与蔡琪琪[14]研究的结果相似。发酵结束后pH值降低至3.66，而总酸含量达到最大值7.80 g/L，显著高于其它发酵时间样品的总酸含量（P＜0.05）。

2.1.3 氨基酸态氮与可溶性固形物含量的变化规律

黄酒发酵过程中，氨基酸态氮含量是一个重要的理化指标，通常用其含量来反映氨基酸水平，以衡量黄酒发酵过程中发酵液氮源含量、蛋白质水解程度以及样品质量等[18-19]。黄酒发酵过程中氨基酸态氮的含量是一个动态变化过程，蛋白酶酶解蛋白质生成氨基酸态氮的同时，微生物的生长代谢和发酵也在不断地利用氨基酸态氮。红谷黄酒发酵过程中氨基酸态氮与可溶性固形物含量的变化见图3。

图3 红谷黄酒发酵过程中氨基酸态氮与可溶性固形物含量的变化Fig.3 Changes of amino nitrogen and soluble solid content during red millet Huangjiu fermentation

由图3可知，氨基酸态氮含量在发酵过程中整体呈上升趋势，前酵阶段（发酵前7 d），由于营养物质丰富且温度适宜，酵母菌等微生物生长代谢旺盛，消耗氨基酸态氮较多，因此其含量稳定在0.27 g/L～0.58 g/L；而后酵阶段（8 d～30 d），发酵液需通过降温处理使温度降至18℃以下，再打入后酵罐中，并维持在16℃～18℃后酵，较低的温度及发酵液中的营养匮乏限制了微生物的生长和代谢，进而使氨基酸态氮消耗减少，并且由于环境的改变，微生物发生自溶，发酵液中的游离菌体蛋白质受蛋白酶的作用，分解成肽和氨基酸，导致氨基酸态氮富集，因此后酵阶段氨基酸态氮含量逐渐升高至最大值1.06 g/L，显著高于其它发酵时间样品（P＜0.05），这与陈青柳等[20]在研究绍兴黄酒发酵后期氨基酸态氮的富集结果相一致。可溶性固形物可赋予黄酒甜味与醇厚感，是影响黄酒口感及标准的重要指标。其在发酵过程中呈先下降后波动上升的趋势，发酵开始时，酵母菌等微生物发酵代谢旺盛，酒液中糖类等营养物质分解较快，随着发酵过程进行，酵母菌代谢速度减慢，可溶性固形物含量逐渐稳定于10.59 °Brix～12.25 °Brix。

2.2 红谷黄酒发酵过程中颜色特性分析

颜色是黄酒最直观的品质特性，也是影响消费者选择产品的重要因素。红谷黄酒发酵过程中颜色的变化见表2。

表2 红谷黄酒发酵过程中颜色的变化Table 2 Changes of color during red millet Huangjiu fermentation

由表2可知，随着发酵过程的进行，L*值呈波动上升的趋势，发酵结束时总体亮度上升了3.50%，由a*、b*和ΔE值的变化趋势可以看出，发酵结束后红谷黄酒的红、黄色值下降，总色差值于发酵第5天时达到最大值4.05，并且CI、Hue上升。引起上述红谷黄酒发酵过程中各颜色指标变化的原因，可能是由于在酿造过程中酚类物质自身发生氧化缩合，同时其还可与酿酒生化体系中其他成分作用共同呈色，从而加深了红谷黄酒色泽[21]。

2.3 红谷黄酒发酵过程中总酚与总黄酮含量的变化规律

黄酒在发酵过程中多酚、黄酮类等功能活性物质会从原料中溶出，且酿造体系复杂多变的生物化学反应，也会生成各类活性成分，例如单宁分子转化为多酚类物质、蛋白质水解成氨基酸或活性多肽等，这些活性物质赋予黄酒抗氧化、抗衰老、抗菌消炎及免疫调节等多种生理功能[22]。红谷黄酒发酵过程中总酚与总黄酮含量的变化见图4。

图4 红谷黄酒发酵过程中总酚与总黄酮含量的变化Fig.4 Changes of total phenols and flavonoids contents during red millet Huangjiu fermentation

由图4可知，红谷黄酒发酵过程中总酚、总黄酮含量总体呈波动上升的趋势。发酵前4 d总酚、总黄酮含量增加较快，这主要是由于前期酿造体系中微生物繁殖、代谢作用强，发酵液乙醇含量升高较快，使得原料中的总酚、总黄酮不断溶出，并且在酵母菌以及酶的作用下原料中的部分结合酚类也会转化为游离酚类溶出，从而导致含量升高[23]；发酵第5天时，总酚、总黄酮含量显著下降（P＜0.05），总酚、总黄酮的下降可能是由于酚类物质氧化或与其它成分发生聚合所致。随后进入后酵阶段（8 d～30 d），总酚含量继续增加，总黄酮含量波动上升，发酵结束时总酚、总黄酮含量显著高于前酵阶段（发酵前 7 d）的样品（P＜0.05），这说明后酵阶段原料中酚类物质还可由于微生物和乙醇作用继续缓慢溶出。由于黄酮类物质稳定性差，易受到pH值、还原性物质等环境因素的影响，并且在发酵过程中的酶促、非酶促褐变、氧化反应以及可逆聚合、缩合反应都可能会对黄酮类物质有影响，因此黄酮类物质含量在发酵中出现波动现象[24]。

2.4 红谷黄酒发酵过程中多酚类物质组成及含量的变化规律

黄酒发酵体系中具有复杂的微生物组成，例如酵母、霉菌和细菌产生的酶系、酒精等各种物质，它们的共同作用促进了原料中多酚类化合物的释放。因此，探究发酵过程中不同酚酸含量的变化规律，不仅可进一步研究出黄酒中酚类化合物的主要组成成分，还可反映出发酵体系中微生物以及物质变化规律。红谷黄酒发酵过程中多酚类物质组成及含量的变化见表3。

表3 红谷黄酒发酵过程中多酚类物质组成及含量的变化Table 3 Changes of polyphenol composition and content during red millet Huangjiu fermentation mg/L

由表3可知，在发酵过程中，香草酸、愈创木酚和苯甲酸含量最高，占总酚酸的80%以上，其中愈创木酚上升幅度最大。此外，上述3种酚酸在进入后酵阶段时有所下降，表明后期可能参与微生物的代谢转化或发生氧化反应而减少[13，25]。除儿茶素、阿魏酸和水杨酸外，其它酚类物质在发酵结束后其含量均显著高于发酵第1天的样品（P＜0.05），表明发酵过程促进了其释放。阿魏酸在发酵第1天时含量显著高于其它发酵时间的样品（P＜0.05），这可能由于酿酒酵母在发酵过程中将其降解为苯酚和4-乙烯基愈创木酚，而产生甜味和香气[15]。

2.5 红谷黄酒发酵过程中γ-氨基丁酸含量的变化规律

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种重要的抑制性神经递质，也是黄酒中重要的活性物质，具有降压、改善脑功能、增强长期记忆以及抗焦虑等功能活性[26]。红谷黄酒发酵过程中γ-氨基丁酸含量的变化规律见图5。

图5 红谷黄酒发酵过程中γ-氨基丁酸含量的变化Fig.5 Changes of GABA content during red millet Huangjiu fermentation

由图5可知，GABA含量在前酵阶段（发酵前7 d）整体呈上升趋势，后酵阶段呈先上升后下降的趋势。在发酵过程中，GABA含量是动态变化的，其不仅可由微生物产生的谷氨酸脱羧酶作用于谷氨酸生成，又可被微生物分解为氨基酸、有机酸等物质。赵文红等[27]在研究客家黄酒发酵过程中γ-氨基丁酸的变化时发现，由于前酵阶段微生物生长繁殖快，使得GABA合成的关键酶谷氨酸脱羧酶活性呈上升趋势，因此，合成GABA较多，随后由于酸度以及酒精度的变化，使得体系中的生化反应以及微生物结构发生改变，导致后期呈现波动趋势。红谷黄酒发酵结束时，GABA含量不足30.00 mg/L，龚金炎等[26]研究的传统手工黄酒发酵结束时GABA含量达到120.56 mg/L，是红谷黄酒的4倍左右，因此在GABA含量方面，红谷黄酒存在不足，后期还需要继续研究发酵过程中GABA的形成机理，以期提升产品的GABA含量。

3 结论

通过研究红谷黄酒在发酵过程中品质变化的规律发现，还原糖含量整体呈下降趋势，后期逐渐稳定于5.93 g/L，酒精度在前酵阶段增加迅速，在后酵阶段略微降低，于第20天时达到最大值15.55%vol；总酸含量呈先上升后下降再上升的趋势，于发酵结束时达到最大值7.80 g/L，pH值的变化则与之相反，发酵第30天时达到3.66；氨基酸态氮含量由0.28 g/L升高至1.06 g/L，可溶性固形物在发酵结束时含量显著降低（P＜0.05），并且发酵改变了红谷黄酒的颜色；红谷黄酒在发酵过程促进了酚类物质的释放，总酚、总黄酮含量总体呈波动上升的趋势，发酵结束时总酚和总黄酮含量显著高于发酵第1天的样品（P＜0.05），在酚酸中香草酸、愈创木酚和苯甲酸含量占比最高（80%以上）；相较于其它类型黄酒，红谷黄酒中γ-氨基丁酸含量存在不足，但发酵结束时含量仍显著高于发酵第1天的样品（P＜0.05），后期需针对该现象进一步研究以提升产品质量。以上规律可为红谷黄酒发酵条件优化、品质提升以及工业化生产提供理论参考，并为进一步开发具有针对性的新型功能红谷黄酒提供理论依据。