陆惠芳

（苏州市吴江区疾病预防控制中心，江苏 苏州 215200）

食品微生物研究是一项非常重要的科研工作。食品中的微生物群落结构、种类、数量以及微生物的代谢活动等方面的研究，对于确保食品的安全性和质量具有至关重要的意义[1-2]。传统的微生物研究方法需要进行微生物的培养和分离，不仅耗时费力，而且可能存在漏检或误检的情况。随着高通量测序技术的发展，食品微生物研究领域中的研究方法也得到了革新[3]。

高通量测序技术的引入，可直接从食品样品中提取DNA 并进行大规模测序，以此来研究食品中微生物的群落组成、数量和活动等方面的情况[4]。这种方法具有高灵敏度、高准确性和高效率等特点，不仅能够提高微生物检测的准确性，而且还能够对微生物的基因组结构和功能等方面进行深入研究[5]。高通量测序技术在食品微生物研究领域中的应用范围非常广泛，如可用于检测食品中的致病微生物、研究食品加工过程中微生物的变化、探究微生物与食品品质关系等。此外，高通量测序技术还可为食品安全保障提供科学依据和技术支持。

高通量测序技术在食品微生物研究领域中的应用已成为研究人员热衷追求的技术之一[6]。相信未来随着技术的不断发展和完善，高通量测序技术将会在食品微生物研究中发挥更为重要的作用，为食品安全保障提供更加可靠的技术手段，成为食品微生物研究领域中的热门技术[7]。

1 高通量测序技术原理及技术流程

高通量测序技术是一种利用大规模并行测序的方法，快速高效地对样品中的DNA 或RNA 进行测序，从而得到其序列信息的技术。其基于光学信号检测技术和生物化学反应原理，可将样品DNA/RNA序列信息转化为光学信号进行检测和记录。

1.1 样品处理

需要对样品进行处理，如提取DNA/RNA 等，再进行纯化和浓缩，以获得足够的DNA/RNA 量进行下一步的操作。此外，为避免污染和失真，还需要进行质量检测和核酸定量等步骤。

1.2 DNA/RNA 文库构建

需要构建DNA/RNA 文库，即将样品DNA/RNA片段插入适当的载体中，如Illumina 公司的TruSeq Nano DNA Library Prep Kit 等。这一步是测序前的重要准备工作，对后续的测序质量和准确性有着至关重要的影响。

1.3 测序平台选择

根据不同的测序目的和需求，需要选择不同的测 序 平 台，如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore等。其中，Illumina 测序平台是最常用的高通量测序平台之一，其核心技术是桥式扩增和测序-bysynthesis 技术，可在较短的时间内高效地测序大量的DNA/RNA 样品。

1.4 测序操作

在进行测序操作时，首先需要对文库进行芯片上的捕获和扩增，随后使用光学技术进行测序，如Illumina 平台中的单端测序、双端测序和Mate-Pair测序等。在测序过程中，利用不同荧光标记的核酸碱基在测序芯片上的顺序排列，记录每一个碱基的光学信号，从而得到样品的DNA/RNA 序列信息。

1.5 数据分析

测序完成后，需要对所得到的数据进行处理和分析，包括数据质量控制、去除低质量序列、拼接序列、比对序列和注释基因等步骤。这些步骤需要借助生物信息学工具和软件进行处理，如Trim Galore、Bowtie、BLAST 等。

2 食品微生物样品的DNA 提取和质量控制

2.1 样品的采集和处理

对于食品微生物样品的DNA 提取和质量控制来说，样品的采集和处理是至关重要的一步。样品的采集应该尽可能地避免污染和损伤，以保证提取到的DNA 质量和数量的准确性。在采集前，应该做好消毒和洗手等步骤，选择适当的采集工具和容器，并避免过度处理和剧烈摇晃等可能影响样品DNA 的因素。

样品的质量控制也是非常重要的一步。通过一系列的实验和检测，可评估样品的纯度、完整性、浓度和大小等因素，以确保提取出的DNA 质量和数量的可靠性。一些常见的样品质量控制方法包括电泳分析、紫外分光光度计测定、比色法检测和荧光分析等。根据实验需求和样品特点，可选择合适的方法和工具进行样品质量控制，以保证后续实验的准确性和可靠性。

2.2 DNA 提取方法及质量控制

在食品微生物研究领域，从样品中提取高质量的DNA 是进行分子生物学实验的关键步骤。由于不同类型的食品微生物样品具有不同的特点，因此在DNA 提取方法和质量控制方面也存在一定的差异。

常用的DNA 提取方法包括酚/氯仿法、磁珠法、酶解法和离心柱法等。其中，酚/氯仿法是最常用的方法之一，其原理是通过酚/氯仿溶解细胞膜和蛋白质，从而分离出DNA。这种方法操作简单、成本较低，适用于大多数微生物样品。磁珠法则利用表面修饰的磁珠吸附目标DNA，从而实现DNA 的快速、高效提取。该方法适用于不同来源的样品，但通常需要较高的设备和试剂成本。酶解法和离心柱法则适用于不同类型的样品，如酵母、真菌、环境样品等。

对于DNA 提取后的质量控制，常用的方法包括比色法、荧光分析、凝胶电泳分析等。其中，比色法和荧光分析可测定DNA 的浓度和纯度，以评估DNA 样品的质量；凝胶电泳分析则可确定DNA 的大小和完整性。通过这些方法可评估提取出的DNA是否可用于后续实验，是否需要进行进一步纯化和浓缩等处理。此外，也可利用定量PCR 等方法评估DNA 的纯度和浓度。

3 高通量测序数据的处理和分析

3.1 数据质量控制和过滤

高通量测序数据量庞大，质量也存在一定的波动，因此需要进行数据质量控制和过滤，以保证后续分析的准确性和可靠性。

在数据质量控制和过滤的基础上，进行进一步的分析，如比对、组装、注释和功能分析等。这些分析的准确性和可靠性也依赖于数据的质量。因此，在实际操作中，研究人员需要根据具体情况选择合适的质量控制和过滤方法，同时根据数据的特点和实验需求进行优化和调整。

3.2 群落组成分析

在食品微生物样品中，微生物群落的组成结构和多样性是研究的重点之一。在高通量测序数据处理和分析中，群落组成分析是一个重要的分析流程。

群落组成分析主要包括物种注释和分类两个方面。物种注释是将高通量测序数据中的序列与已知物种的参考数据库进行比对，从而确定序列对应的物种分类信息。在群落组成分析中，通常使用SILVA、Greengenes、NCBI 等公共数据库作为物种注释的参考数据库。分类则是根据物种注释结果，统计各个分类单位（如门、纲、目、科、属和种）的丰度，从而揭示样品中微生物群落的组成结构。

在实际操作中，群落组成分析可通过多种软件实现。其中，常用的软件包括QIIME、mothur、MG-RAST 等。这些软件包提供了一系列分析流程和工具，可完成数据的质量控制、物种注释、分类、群落多样性计算和比较等分析。例如，QIIME 可完成物种注释、群落丰度统计、群落多样性计算等分析；mothur 可进行OTU 聚类、物种注释、多样性计算等；MG-RAST 则可进行物种注释、功能注释等分析。

群落组成分析的结果可通过各种图表展示。例如，热图、曲线图、饼图和条形图等可直观地展示各个分类单位的丰度和比例分布。此外，群落多样性指数，如Shannon 指数、Chao1 指数、Simpson 指数等也是衡量样品微生物群落多样性的重要指标。

3.3 基因功能注释和代谢通路分析

在高通量测序数据处理和分析中，基因功能注释和代谢通路分析是重要的分析流程。这些分析有利于深入了解微生物基因功能和代谢通路在食品微生物中的作用，为研究微生物在食品加工、储存等过程中的功能和作用提供重要信息。基因功能注释的目的是将高通量测序数据中的序列与已知基因功能的参考数据库进行比对，从而确定序列对应的功能信息。在食品微生物研究领域，KEGG 数据库是一个常用的参考数据库，其中包含了广泛的代谢通路信息和基因注释信息。代谢通路分析通常使用KEGG Pathway 数据库，基于物种注释结果和基因功能注释结果进行通路注释和丰度统计，从而确定样品微生物代谢通路的丰度和比例分布。代谢通路分析有利于更深入地了解样品微生物的生理特征和代谢机制。

在实际操作中，基因功能注释和代谢通路分析可通过多种软件实现。例如，MG-RAST、STAMP、KOBAS 等软件包可完成KEGG 数据库中的基因注释、代谢通路注释和丰度统计等功能。此外，R 软件和Python 等编程语言也可用于代谢通路分析和可视化。

4 高通量测序技术在食品微生物研究中的应用

4.1 食品中微生物群落结构的分析

高通量测序技术在食品中微生物群落结构的分析已经成为食品微生物学研究中的一个重要领域。通过对食品样品中微生物DNA的高通量测序和分析，可获得丰富的微生物群落信息，方便了解食品微生物的种类、数量和分布等方面的信息。

在进行食品微生物群落结构的分析之前，需要对样品进行处理和准备。一般来说，对于食品样品的DNA 提取和纯化需要特别注意，因为食品中存在多种干扰物质，如脂肪、多糖、蛋白质等，这些物质可能对DNA 提取和纯化造成影响，影响后续的测序结果。因此，需要选择合适的DNA 提取方法，如采用商业化的基于磁珠或硅胶的DNA 提取试剂盒，来克服这些干扰。此外，在进行高通量测序之前，需要将DNA 样本转化为文库。建立文库的方式有多种，其中包括插入文库和整合文库。插入文库构建方式是将DNA 样本通过限制性内切酶切割，接上适配体，经过PCR 扩增后构建文库；整合文库构建方式则是通过用化学方式将DNA 片段粘合到一起来构建文库。选择何种构建文库方式需要考虑到样品的性质和后续分析的目的等因素。

4.2 食品中致病微生物的检测和鉴定

高通量测序技术在食品中微生物的检测和鉴定方面具有广泛的应用前景。通过高通量测序技术对食品中微生物的DNA 序列进行测序，可实现对食品中致病微生物的检测和鉴定。通常采用的方法是通过建立与该致病微生物DNA序列特异性相应的引物，进行PCR 扩增，再对扩增产物进行高通量测序。同时，基于高通量测序技术的大规模样品处理优势，可实现对多个样品同时进行高通量测序，从而大大提高检测效率。在致病微生物的检测和鉴定中，需要将高通量测序得到的数据进行质量控制和过滤，再进行序列比对和物种注释。比对序列通常使用基于参考序列的序列比对算法，如Bowtie2 和BWA 等。在物种注释方面，通常使用一些常用的基因组数据库，如NCBI、Uniprot 和KEGG 等。同时，通过比对分析，可以对微生物的特征序列（如16S rRNA）进行比较，从而确定微生物的种类和丰度。

4.3 食品加工过程中微生物的变化和演替

在食品加工过程中，微生物的变化和演替是一个复杂的过程，其对食品质量和安全具有重要的影响。高通量测序技术为研究食品加工过程中微生物变化和演替提供了有力的工具和方法。

在食品加工过程中，微生物数量和种类会发生变化，且变化的速度和幅度取决于不同的食品加工过程。高通量测序技术通过测序样品中微生物的DNA序列，可得到微生物群落的丰度和组成信息，从而揭示微生物在不同加工过程中的变化和演替规律。通常采用的方法是对样品进行高通量测序，再将测序数据进行质量控制和过滤，进行微生物群落结构的分析。在食品加工过程中，不同的微生物之间相互作用，共同影响着微生物群落的演替过程。高通量测序技术不仅可研究微生物群落的丰度和组成，还可探究微生物的代谢通路和基因表达谱等信息，从而深入了解微生物间的相互作用机制。此外，高通量测序技术还可为探究微生物间相互作用的功能基因和代谢通路等提供大量的数据支持。

4.4 食品微生物与食品品质关系的研究

高通量测序技术已经被广泛应用于食品微生物与食品品质之间关系的研究中。随着消费者对食品安全和品质的关注日益增加，越来越多的研究人员开始关注食品微生物与食品品质之间的关系，同时利用高通量测序技术进行深入研究。

食品微生物在食品加工和贮存过程中会对食品的品质产生影响。因此，研究食品微生物与食品品质之间的关系对于改善食品品质具有重要的意义。利用高通量测序技术可对食品中微生物群落结构进行分析，并挖掘微生物与食品品质之间的关系。

通过高通量测序技术，研究人员可获得食品中微生物的种类和数量信息，并探索微生物的功能特性。例如，利用基于16S rRNA 的高通量测序技术可对食品中的细菌群落进行分析，从中筛选出可能对食品品质具有影响的微生物。此外，利用基于ITS的高通量测序技术可对真菌群落进行分析，了解其对食品的影响。此外，研究人员还可将高通量测序技术与其他分析技术相结合，如化学分析和感官评价等，进一步探究微生物与食品品质之间的关系。例如，将高通量测序技术与挥发性化合物分析相结合，探究微生物代谢产物对食品风味的影响。

5 结语

高通量测序技术已经成为食品微生物学研究领域的重要工具，有利于更深入地了解食品微生物群落的结构、代谢功能、致病微生物的检测和鉴定等方面。在研究过程中，DNA 提取和质量控制、文库构建和测序平台选择等步骤都需要特别注意，以确保测序数据的准确性和可靠性。在数据处理和分析过程中，数据质量控制和过滤、群落组成分析、基因功能注释和代谢通路分析等都是非常重要的环节。高通量测序技术的应用已经为深入了解食品微生物的多样性、变化和演替，以及微生物与食品品质的关系提供了更全面、深入的视角。这些研究成果将有助于更好地保护食品安全、改善食品品质，为人们的健康和生活作出更大的贡献。