刘璇璇，武莹敏，朱振宝，李道明，王建康，黄峻榕，冯莉，曹云刚

（陕西科技大学食品科学与工程学院，陕西西安 710021）

核桃属胡桃科胡桃属植物，是传统健脑食物，有“健脑果”、“美容果”、“木本粮油之王”等美称。脂肪和蛋白质是核桃仁的主要营养成分。核桃油富含人体必需脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量高达90%。据报道，多不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸对糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病等有一定的预防作用，同时还具有增强免疫力，延缓衰老，促进大脑、神经系统和视网膜发育的作用。此外，核桃油中还含有多种维生素及矿物元素，具有细胞修复、消炎、抗病毒、抗血栓等功效。核桃蛋白是一种优质蛋白质，其氨基酸种类齐全、组成合理。研究表明，核桃蛋白酶解物具有改善记忆力、降血压、降尿酸、抗氧化、抗癌、降血糖、抗疲劳等多种生理功能，因而受到越来越多研究者的关注，已用于新型生物活性肽的分离及应用研究。

核桃油的提取方法主要有压榨法、溶剂浸提法等。压榨法操作简单、绿色、无污染、营养价值保留度高，但饼粕残油多。而溶剂浸提法得到的油可能存在溶剂残留的问题。与这些传统的提油方法相比，水酶法是一种环境友好的提油技术，具有安全、高效、成本低、可同时获得油脂和蛋白质等优点。迄今为止，水酶法已在多种含油原料的提油工艺研究中得以应用，如胡麻子、元宝枫、油茶籽、红花籽等。目前也有部分研究者对水酶法提取核桃油的工艺开展了相关研究，但是复合酶对核桃油和核桃多肽的联产效果鲜见报道。

本研究通过比较4 种不同的蛋白酶与纤维素酶复配对核桃提油率及多肽产量的影响，旨在筛选出最佳酶组合；在此基础上，探究酶解pH、酶解温度、酶解时间、料液比、加酶量对核桃提油率以及多肽产量的影响，最终确定水酶法制备核桃油和核桃多肽的最佳联产工艺条件，以期为水酶法在核桃油和核桃多肽联产的产业化应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆阿克苏薄皮核桃 市场购买无霉变、无蛀虫、新鲜优质的核桃；纤维素酶（700 EGU/g）、复合蛋白酶（1.5 AU-N/g）、碱性蛋白酶（2.4 AU-A/g）、中性蛋白酶（>1600 AU/g）诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准品 上海源叶生物科技有限公司；GLC Mixture GLC-461 上海安谱实验科技股份有限公司；正己烷色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

HR/T20MM 立式高速冷冻离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；DK-8D 电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司；pHS-3E pH 计 上海仪电科学仪器股份有限公司；GENIUS 4K 台式低速离心机长沙市鑫奥仪器仪表有限公司；UV2800/UV2800S双光束紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；ME204E/02 电子分析天平、HE53/02 水分测定仪 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KN520 自动凯氏定氮仪、SE-A6 全自动脂肪测定仪济南阿尔瓦仪器有限公司；VORTEX 2 旋涡混合器 艾卡（广州）仪器设备有限公司；de4116 电动搅碎机 佛山市顺德区顺之然电器实业有限公司；GC-2010 pro 气相色谱仪 岛津企业管理（中国）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 核桃预处理 核桃去壳，于破碎机中进行破碎处理，直至获得均匀的细浆为止，4 ℃冷藏备用。

1.2.2 核桃仁主要成分测定 参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法测定核桃仁的蛋白质含量；参照GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》，采用索氏提取法测定核桃仁的脂肪含量；利用水分测定仪测定核桃仁的水分含量。

1.2.3 水酶法提油及提油率的测定 称取6 g 核桃仁细浆，按料液比1:4（g/mL）加入蒸馏水，搅拌均匀后置于50 ℃水浴锅中预热，1 h 后取出样品，调节pH 为7.0，加酶量为3%（蛋白酶:纤维素酶=2:1），搅匀后置于60 ℃水浴锅中酶解2.5 h，酶解过程中维持pH 不变，酶解结束后90 ℃加热10 min 灭酶，冷却至室温，8000 r/min 离心30 min，收集核桃清油和核桃多肽水解液。

将乳化层以及油乳混合层收集之后进行二次离心，8000 r/min 离心20 min，收集核桃清油和核桃多肽水解液。将两次离心所得的核桃清油和核桃多肽水解液进行合并，同时记录核桃多肽水解液的体积，并计算核桃提油率。核桃提油率计算公式如下：

式中：X 为核桃提油率，%；m 为核桃油质量，g；M 为核桃仁质量，g；C 为核桃仁中油脂质量分数，%。

1.2.4 核桃多肽产量的测定 采用双缩脲法测定核桃多肽产量，试验步骤如下。

1.2.4.1 双缩脲试剂的配制 称取0.375 g 硫酸铜（CuSO·5HO）和1.5 g 酒石酸钾（KNaCHO·4HO），用125 mL 蒸馏水溶解，然后加入75 mL 10%的NaOH，最后用蒸馏水定容至250 mL，即得双缩脲试剂。

1.2.4.2 标准曲线的制作 采用梯度稀释法，用体积分数为5%的三氯乙酸（TCA）将Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准品依次配制成0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 和1.8 mg/mL 的四肽标准溶液，分别取6.0 mL 标准溶液加入4.0 mL 双缩脲试剂，置于旋涡混合器混匀，静置20 min 后，4000 r/min 离心10 min，取上清液于540 nm 波长下测定OD 值（以第一管做空白对照），以多肽浓度为横坐标X（mg/mL），OD 值为纵坐标Y，得到标准曲线为：y=0.3154x+0.0129（R=0.9953）。

1.2.4.3 水解液中多肽含量的测定 取2.5 mL 核桃水解液加入2.5 mL 10%的TCA，置于旋涡混合器混匀，静置20 min 后4000 r/min 离心10 min，转移上清液到50 mL 容量瓶中并用5%的TCA 定容，取6.0 mL 上述溶液置于另一试管中并加入双缩脲试剂4.0 mL，混匀并静置20 min 后于4000 r/min 离心10 min，取上清液于540 nm 下测定OD 值，对照标准曲线求得水解液中的多肽浓度。

已知水解液体积、原料质量以及水解液中的多肽浓度，核桃多肽产量的计算公式如下：

1.2.5 最佳酶组合的筛选 在酶解温度60 ℃、pH7.0、酶解时间2.5 h、料液比1:4（g/mL）、加酶量3%下，考察4 种不同的酶组合（木瓜蛋白酶和纤维素酶、碱性蛋白酶和纤维素酶、复合蛋白酶和纤维素酶、中性蛋白酶和纤维素酶，各酶组合中蛋白酶与纤维素酶比例均为2:1）对核桃提油率以及多肽产量的影响，从而确定最佳酶组合。

1.2.6 单因素实验 基于1.2.5 试验结果，开展单因素实验。在酶解温度60 ℃、酶解时间2.5 h、料液比1:4（g/mL）、加酶量3%的条件下，考察不同酶解pH（5、6、7、8 和9）对核桃提油率以及多肽产量的影响；在酶解pH6、酶解时间2.5 h、料液比1:4（g/mL）、加酶量3%的条件下，考察不同酶解温度（30、40、50、60 和70 ℃）对核桃提油率以及多肽产量的影响；在酶解pH6、酶解温度50 ℃、料液比1:4（g/mL）、加酶量3%的条件下，考察不同酶解时间（1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 h）对核桃提油率以及多肽产量的影响；在酶解pH6、酶解温度50 ℃、酶解时间2.5 h、加酶量3%的条件下，考察不同料液比（1:3、1:4、1:5、1:6和1:7（g/mL））对核桃提油率以及多肽产量的影响；在酶解pH6、酶解温度50 ℃、料液比1:4（g/mL）、酶解时间2.5 h 的条件下，考察不同加酶量（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%）对核桃提油率以及多肽产量的影响。

1.2.7 正交试验 在单因素实验基础上，以酶解温度、pH、酶解时间、料液比、加酶量为因素，以核桃提油率以及多肽产量为指标，进行L（3）正交试验，确定最佳工艺条件。每组试验重复3 次，结果取平均值，正交试验因素与水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.2.8 核桃油脂肪酸组成分析

1.2.8.1 核桃油的甲酯化 取20 μL 核桃油于10 mL离心管中，加入2 mL 正己烷，振荡混匀，再加入0.5 mL 2 mol/L 的氢氧化钾-甲醇溶液，室温甲酯化5 min后，按照0.5 g/mL 向混合溶液中加入无水硫酸钠，振荡脱水，1000 r/min 离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.2.8.2 定性定量方法 气相色谱条件：FBX-10 色谱柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm），气化室温度250 ℃，进样口温度120 ℃，进样量1 μL，分流比100:1。以N为载气，N流量35 mL/min，H流量40 mL/min，空气流量400 mL/min。

1.3 数据处理

采用Excel 软件对数据进行整理，采用SPSS Statistics 26.0 软件对数据进行统计分析，每组试验数据重复测定3 次，实验结果均以“平均值±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 核桃仁主要成分

本试验所用的新疆阿克苏薄皮核桃主要成分如表2 所示。

由表2 可知，核桃仁脂肪含量较高，为70.05%，另外核桃仁中还含有13.86%的蛋白质，这与Pereira等报道的6 个不同品种的核桃仁脂肪含量（68.83%～72.14%）及蛋白质含量（14.38%～18.03%）基本一致。

表2 核桃仁的主要成分Table 2 Main ingredients of walnut kernel

2.2 不同酶组合对核桃提油率以及多肽产量的影响

由图1 可知，复配酶中蛋白酶的种类对核桃提油率以及多肽产量的影响顺序大小依次为：木瓜蛋白酶>碱性蛋白酶>复合蛋白酶>中性蛋白酶，4 种不同的蛋白酶与纤维素酶复配得到的提油率及多肽产量均有显著性差异（<0.05），其中木瓜蛋白酶与纤维素酶复配得到的提油率及多肽产量均显著高于其它酶组合（<0.05），因此，在加酶量相同的情况下木瓜蛋白酶与纤维素酶复配效果最佳，并以该酶组合进行后续的单因素实验。

图1 不同酶组合对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.1 Effects of different enzyme combinations on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.3 单因素实验结果

2.3.1 酶解pH 对核桃提油率及多肽产量的影响由图2 可知，pH 为5.0～6.0 时，核桃提油率和多肽产量均呈上升趋势，在此范围内核桃多肽产量显著提高（<0.05），而核桃提油率无明显变化（>0.05），当pH 为6 时二者均达到最大值，pH 超过6 后，随着pH 的增大二者均呈下降趋势。水酶法提取核桃油和核桃多肽过程中，pH 过高或过低都会影响纤维素酶和木瓜蛋白酶的活性，进而影响细胞壁的降解、脂蛋白的水解，致使提油率和多肽产量降低。此外，pH 过高，蛋白质乳化程度也随之加剧，提油率和多肽产量都有所下降。pH 为6 时最接近酶反应的最佳pH，此时细胞壁的损伤程度和蛋白质的水解度均增大，包裹在蛋白质中的油脂释放更完全。因此最佳酶解pH 为6。

图2 酶解pH 对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.2 Effect of pH on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.3.2 酶解温度对核桃油提取率及多肽产量的影响由图3 可知，在酶解温度30～60 ℃范围内，提油率随温度的上升而升高，当酶解温度达到60 ℃时，提油率达到最高，而多肽产量则呈现先上升后下降的趋势，最高点对应的酶解温度为50 ℃，当温度超过50 ℃后多肽产量显著下降（<0.05），而提油率无明显变化（>0.05）。这主要是因为酶的活性受温度影响较大，当温度接近酶作用的最佳温度时，酶的活性增强，反应更彻底，而温度过高或者过低都会影响酶的活性，进而影响提油率及核桃多肽产量。林莉等在采用水酶法提取薏米糠油时也证实，酶解过程中若温度过高，提油率下降。综合考虑核桃提油率和多肽产量这两个指标，选择最佳酶解温度为50 ℃。

图3 酶解温度对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.3.3 酶解时间对核桃油提取率及多肽产量的影响由图4 可知，在酶解时间1.5～3.5 h 范围内，提油率以及多肽产量均呈现先上升后下降的趋势，酶解时间为2.5 h 时核桃的提油率及多肽产量均显著高于其它酶解时间（<0.05）。随着酶解时间的延长，细胞壁损伤程度以及蛋白质水解度均增大，油脂的释放量也相应增加；酶解时间过长，提油率及多肽产量反而有所下降，可能是因为核桃多肽参与了油脂乳化，导致油脂不易分离，同时水解液中的多肽含量也有所下降。因此最佳酶解时间为2.5 h。

图4 酶解时间对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.4 Effect of enzymolysis time on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.3.4 料液比对核桃油提取率及多肽产量的影响由图5 可知，核桃提油率随料液比的增大呈现先升高后下降的趋势，当料液比为1:4（g/mL）时，提油率达到最高，超过此点后，核桃提油率显著下降（<0.05）。这主要是因为水作为提取油脂过程中反应介质，能促进酶解反应，料液比过高会使油脂乳化加剧，油相稀薄，油脂不易分离，而料液比太低会使整个体系粘度增大，影响酶和底物反应，使得提油率下降。李静等在采用水酶法提取牡丹籽油时也证实，随着液料比增加，提油率先上升后下降，与本研究结论一致。核桃多肽产量则随料液比的增大呈现逐渐升高的趋势，这可能是因为随着料液比的增大，酶与底物更易结合，酶解反应越充分，从而使得多肽产量增加。与料液比为1:4（g/mL）时的多肽产量相比，料液比为1:5（g/mL）时的多肽产量无显著提高（>0.05），而提油率却显著降低（<0.05）。尽管料液比为1:6（g/mL）时的多肽产量要显著高于料液比为1:4（g/mL）时的多肽产量（<0.05），但提油率却急剧下降，由1:4（g/mL）时的57.01%降至46.36%（<0.05）。因此，为了使核桃具有较高的综合利用率，选择最佳料液比为1:4（g/mL）。

图5 料液比对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.3.5 加酶量对核桃油提取率及多肽产量的影响由图6 可知，当加酶量在2.0%～3.0%范围内时，加酶量的增加能有效提高提油率（<0.05），主要是因为大分子蛋白质在蛋白酶的作用下水解，包裹在蛋白质内部的油脂得以释放。当加酶量超过3.0%时，提油率增加不显著（>0.05）。祖亭月等在采用水酶法提取橡胶籽油时证实，随着复合酶用量增加，提油率呈先升高后趋于稳定的趋势，与本研究结论一致。核桃多肽产量在加酶量为3.0%时达到最大值，可能是因为当酶制剂作用位点的氨基酸均被切断后，继续增加酶的添加量并不能有效提高核桃多肽产量。综合考虑提油率、多肽产量以及酶的成本，选择酶的添加量为3.0%。

图6 加酶量对核桃提油率以及多肽产量的影响Fig.6 Effects of enzyme dosage on oil extraction rate and polypeptide yield of walnut

2.4 正交试验结果

表3 为提取核桃油正交试验结果。由表3 可知，不同因素对提油率影响的主次顺序依次为：酶解时间>加酶量>酶解pH>料液比>酶解温度，由K 值分析得出最佳的生产工艺方案为：ABCDE，即加酶量3.5%、料液比1:5（g/mL）、酶解pH6、酶解时间3.0 h、酶解温度50 ℃。不同于正交试验结果中提油率最高的第7 组ABCDE，故需要验证试验ABCDE和ABCDE。

表3 核桃提油率正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of the extraction rate of walnut oil

表4 为核桃多肽产量正交试验的结果。由表4可知，不同因素对核桃多肽产量影响的主次顺序依次为料液比>酶解温度>加酶量>酶解时间>酶解pH，由K 值分析得出最佳的生产工艺方案为ABCDE，即加酶量3.5%、料液比1:5（g/mL）、酶解pH7、酶解时间2.0 h、酶解温度60 ℃。不同于正交试验结果中多肽产量最高的第7 组ABCDE，故需要验证试验ABCDE和ABCDE。

表4 核桃多肽产量正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of the yield of walnut polypeptide

2.5 正交结果验证试验

由表5 可知，ABCDE组合的提油率为53.37%，多肽产量为4.01 mg/g，其提油率显著高于ABCDE和ABCDE（<0.05），且多肽产量显著高于ABCDE（<0.05），从而验证了该工艺参数优化组合是可行的，故正交试验得出的最佳工艺参数为：加酶量3.0%，料液比1:5（g/mL），酶解pH5，酶解时间3.0 h，酶解温度60 ℃。

表5 验证试验结果Table 5 Experiment results of verification

2.6 核桃油脂肪酸组成

采用气相色谱法对水酶法最佳工艺条件下提取的核桃油中的脂肪酸组成进行分析，检测结果如图7和表6 所示。

表6 水酶法制取核桃油中脂肪酸组成Table 6 Fatty acid composition in walnut oil by aqueous enzymatic extraction

图7 脂肪酸标准品（A）及水酶法提取的核桃油的色谱图（B）Fig.7 Chromatograms of fatty acids standards (A) and the walnut oil extracted by aqueous enzymatic method (B)

由图7 可知，水酶法提取的核桃油中共检测出5 种脂肪酸，其中饱和脂肪酸2 种，多不饱和脂肪酸2 种，单不饱和脂肪酸1 种。本试验测得主要脂肪酸相对含量由大到小依次为：亚油酸>油酸>-亚麻酸>棕榈酸>硬脂酸，此研究结果与Simsek 等、Zhai等研究结果一致。

由表6 可知，本试验制取的核桃油以不饱和脂肪酸为主，相对含量为91.47%，其中多不饱和脂肪酸含量为72.83%，单不饱和脂肪酸含量为18.64%。不饱和脂肪酸主要为亚油酸和油酸，其中亚油酸含量高达62.26%，油酸的含量为18.64%，另外还含有10.57%的-亚麻酸。这与Li 等用气相色谱法对不同品种核桃的油脂脂肪酸组成检测结果一致。

3 结论

本研究通过比较4 种不同的蛋白酶与纤维素酶复配对核桃提油率及多肽产量的影响，确定了木瓜蛋白酶与纤维素酶复配（2:1，w/w）为最佳酶组合；通过单因素和L（3）正交试验，得出水酶法联产核桃油和核桃多肽的最佳工艺参数为加酶量3.0%，料液比1:5（g/mL），pH5，时间3.0 h，温度60 ℃，在此工艺条件下核桃提油率可达53.37%，多肽产量为4.01 mg/g。利用气相色谱法定性、定量分析了试验制取的核桃油中脂肪酸组成，结果表明核桃油中共检测出5 种脂肪酸，分别为亚油酸（62.26%）、油酸（18.64%）、-亚麻酸（10.57%）、棕榈酸（6.00%）、硬脂酸（2.53%）；核桃油以不饱和脂肪酸为主，总含量高达91.47%，其中多不饱和脂肪酸含量为72.83%，单不饱和脂肪酸含量为18.64%。水酶法作为环境友好、成本低廉的新型提油技术，可同时制备核桃油和核桃多肽，对于核桃资源的充分利用具有重要应用价值。但利用水酶法制备的核桃油的理化性质以及核桃多肽的结构、生物活性等仍需进一步探索。