孟宪敏，张 锋，段韫丹，董春娟，张梦夏，尚庆茂

(中国农业科学院 蔬菜花卉研究所，农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081)

番茄(LycopersiconesculentumMiller.)属于茄科番茄亚属，全世界广泛栽培的蔬菜作物之一，据联合国粮食及农业组织统计，2019年总产量1.81亿t，种植面积503万hm2，总产值860.66亿美元(www.fao.org)。随着设施番茄栽培面积不断扩大，土壤连作障害日趋严重，其品质、产量和效益下降[1]。嫁接作为实际生产中应对土传病害的栽培技术，逐年运用到蔬菜生产上，特别是属间嫁接亲和的葫芦科和茄科作物[2-3]。嫁接可有效克服作物根结线虫等土传病害[4]，提高作物疫霉病与青枯病抗性[5]以及高温或盐胁迫的耐受性[6-8]，从而提高作物品质和产量[9-11]，成为高效且环境友好型农业技术之一。

嫁接愈合进程涉及砧穗组织黏连、隔离层形成和消失、愈伤组织形成以及维管束重连等一系列事件，受砧穗内在遗传物质和外在环境双重影响[12-14]，核心是多种激素信号共同参与嫁接体形成。在番茄嫁接愈合进程中，生长素(IAA)和细胞分裂素(CTK)对嫁接接合部愈伤组织形成和维管束重连起主导作用[15]。Lu等[16]在黄瓜试管苗离体茎段嫁接时施加IAA和玉米素(ZT)，结果发现IAA和ZT是砧穗维管束桥分化的必要条件。外施生长素转运抑制剂(TIBA)于拟南芥子叶，抑制了下胚轴嫁接接合部维管束形成和细胞增殖[13]。当植物遭受创伤后，诱导脱分化基因WIND1(wound induced dedifferentiation1)表达，激活中柱鞘和创伤部位细胞中B类响应因子ARR(arabidopsis response regulator)介导的CTK信号，刺激CTK含量升高，促进创伤面形成愈伤组织[17-18]。

在实际生产中，尤其是夏季育苗过程中，常通过叶面喷施矮壮素(CCC)控制幼苗徒长，调控番茄株型，更便于嫁接，降低育苗成本。CCC主要抑制赤霉素(GA)合成途径中内根-贝壳杉烯合成酶(KS)活性，其活性催化香叶基焦磷酸酯(GGPP)转变为内根-贝壳杉烯。外源喷施CCC可降低GA含量，提高IAA含量，进而增加作物茎叶生物量[19]。Wang等[20]对马铃薯的研究也发现外源CCC可显著提高IAA和玉米素(Z)的含量，马铃薯产量和品质随之提高。在番茄嫁接前育苗期叶面喷施CCC，是否会影响嫁接愈合进程，迄今还鲜见有研究报道。因此，本研究在番茄嫁接前叶面喷施CCC，考察外源CCC对幼苗生长和嫁接接合部植物激素含量的影响，比较愈合进程中维管束重构的差异，以期为番茄嫁接生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与培养

试验于2020年6月至2021年6月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所玻璃温室(39°97′N，116°34′E)进行。试验材料为番茄(LycopersiconesculentumMiller.)接穗品种‘硬粉8号’和砧木品种‘砧爱1号’，均购自京研益农(北京)种业科技有限公司。

挑选籽粒饱满番茄种子，室温浸种6 h，1.0% NaClO消毒5 min，蒸馏水冲洗数次，28 ℃催芽。选取发芽一致的种子播于装有混合基质[草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1(V/V)]的72孔穴盘，播种深度1.5 cm，覆盖蛭石，每盘灌水约1 L，置玻璃温室自然温光条件下生长，昼/夜平均温度分别为(27 ± 3)℃/(18 ± 2)℃，自然光照强度约650 μmol·m-2·s-1，空气相对湿度75%～85%。幼苗子叶平展后，每隔3 d灌溉0.5 g·L-1水溶肥(上海永通化工，20-20-20-TE)。

1.2 试验设计

在嫁接前6和12 d，对‘硬粉8号’和‘砧爱1号’幼苗2次叶面喷施100 mL 100 mg·L-1矮壮素(CCC，有效成分98%，北京索莱宝)，并以喷施等量去离子水为对照(CK)，共2个处理。每处理48株，3次重复。

播种后27 d采用套管嫁接，使用切削器在砧木子叶上方1 cm处切取35°斜面，从顶端插入套管(2.5～3.0 mm×12 mm)，取接穗幼苗与砧木切削部位直径相近处切取35°斜面，使砧穗切面紧密接合。愈合期置于人工气候室(北京格润科尔)，条件为：嫁接后0～3 d，昼/夜温度26 ℃/23 ℃，空气相对湿度(98% ± 2.0%)，黑暗；嫁接后4～7 d，昼/夜温度26 ℃/23 ℃，空气相对湿度80%～90%，光周期12 h，光照强度100 μmol·m-2· s-1；嫁接后8～20 d，昼/夜温度26 ℃/23 ℃，空气相对湿度60%～70%，光周期12 h，光照强度200 μmol·m-2·s-1。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 砧穗生长指标在嫁接前测定幼苗株高、茎粗、上胚轴长度和地上部干鲜重、地下部干鲜重。在嫁接后20 d，采用便携式SPAD-502测定叶片SPAD值，采用氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法测定根系活力[21]。每重复4株，3次重复。

1.3.2 内源生长素、细胞分裂素和赤霉素含量在嫁接后12、48和72 h，取嫁接接合部10 mm茎段(砧穗各含5 mm)，液氮速冻30 min，存于-80 ℃。取50 mg样品加入适量内标，用1 mL甲醇/水/甲酸(15∶4∶1，V/V/V)提取，提取液浓缩后用100 μL 80%甲醇/水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，置于进样瓶，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定生长素、细胞分裂素含量。另取50 mg样品加入适量内标，用500 μL乙腈水溶液提取，离心后取上清液，加入10 μL TEA和10 μL BPTAB，90 ℃反应1 h，氮气吹干，100 μL乙腈水溶液复溶，过0.22 μm滤膜，置于进样瓶，LC-MS/MS测定赤霉素含量[15]。每重复5株，3次重复。

植物激素含量(ng·g-1)=C×V/1 000/m，其中C为标准曲线所求浓度值(ng·mL-1)，V为复溶时所用溶液体积(μL)，m为样品质量(g)。

1.3.3 愈合进程观测在嫁接后48、72、96、120和168 h，取嫁接接合部5 mm茎段(砧穗各含2.5 mm)，每次取样6株，3次重复。立即置于FAA固定液，抽真空后固定24 h以上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，采用RM2245切片机(德国Leica)纵切9 μm，水浴展片后粘片，再经脱蜡复水、番红-固绿染色和封片，BX53荧光成像显微镜(DP73镜头，Olympus)下观察嫁接接合部并选取视野拍照。

1.3.4 维管束连通性观测在嫁接后48、72、96、120和168 h，于嫁接接合部上方1 cm处横切茎段，涂抹5 μL 1 mmol·L-15-CFDA(5-羧基荧光素二乙酸酯)于切口，遮光放置7 h，在接口下方1 cm处横切于BX53荧光成像显微镜(DP73镜头，Olympus)观察荧光。FIJI软件将明场和荧光图片合并以及统计平均荧光强度。3次重复，每重复3株。另取嫁接苗，横切茎基部，垂直放置于10 mL 1%酸性品红4 h，取接合部上方全部真叶，称重，采用德国Retsch球磨仪(MM400)研磨成匀浆，加入5 mL蒸馏水于12 000 r·min-1离心5 min，测定上清液在545 nm处吸光度，计算品红含量。3次重复，每重复4株。另取嫁接苗，横切茎基部后垂直放置于10 mL 1%酸性品红40 min，徒手横切接口上方1 cm处茎段，于SZX16体式显微镜(DP73镜头，Olympus)下观察品红吸收情况。3次重复，每重复3株。

品红吸收含量(mg·g-1·h-1) =C×V×(a×W×t)-1，其中C为标准方程所求品红含量(mg)，V为提取液总体积(mL)，a为测定所取提取液体积(mL)，W为叶片鲜重(g)，t为品红处理时间(h)。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2012整理数据和作图，再用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行独立样本T检验。

2 结果与分析

2.1 CCC对番茄幼苗生长的影响

图1和表1数据显示，与对照组(CK)番茄幼苗相比，嫁接前6和12 d 2次叶面喷施CCC处理的‘硬粉8号’和‘砧爱1号’幼苗株高分别显著降低33.30%、33.96%，茎粗分别显著降低5.31%、8.73%，同时‘硬粉8号’和‘砧爱1号’幼苗上胚轴长度、地上部鲜重，以及‘砧爱1号’幼苗地上部和地下部干重也均显著降低，而2个番茄品种幼苗的地下部鲜重均无显著变化。说明CCC处理显著抑制了番茄幼苗生长，砧木的表现尤为明显。

表1 不同处理下番茄幼苗生长指标的变化Table 1 The growth of tomato seedlings under different treatments

2.2 CCC对番茄嫁接接合部愈合进程影响

2.2.1 嫁接接合部连接过程如图2所示，番茄嫁接接合部在嫁接后48 h受损伤形成隔离层；嫁接后72～120 h接合部薄壁细胞开始分裂增殖，继而分化形成新的木质部和韧皮部；嫁接后168 h维管束完成重构。其中，嫁接前叶面喷施CCC处理的嫁接接合部于嫁接后72 h可见木质部导管分子连接，早于对照；嫁接后96～120 h，CCC处理可明显看到嫁接接合部木质部导管分子与韧皮部基本完成连接，愈伤组织薄壁细胞互相连接，填满接合部间隙。说明嫁接前叶面喷施CCC处理可促进番茄嫁接接合部细胞黏连。

2.2.2 维管束重构过程为进一步了解CCC处理对番茄嫁接愈合进程中维管束重构的影响，通过酸性品红和CFDA经过嫁接接合部的运输情况，分别显示木质部和韧皮部的连接情况(图3)。CCC处理的嫁接接合部维管束品红吸收含量多，显著高于同期CK(图3，Ⅰ、Ⅱ)；同时，CFDA荧光数据(图3，Ⅲ、Ⅳ)显示，番茄嫁接接合部下方1 cm处维管束在嫁接后96 h出现绿色荧光，CCC处理的平均荧光强度高于CK，并在嫁接后120 h差异达到显著水平。由此可见，CCC处理显著促进了番茄幼苗嫁接愈合期接合部木质部和韧皮部重连。

2.3 CCC对番茄嫁接接合部植物激素含量影响

由图4可知，嫁接后12、48和72 h，叶面喷施CCC处理提高了番茄嫁接接合部L-色氨酸(TRP)、吲哚-3-乙酸甲酯(MEIAA)、色胺(TRA)和IAA含量；在嫁接后12和48 h，CCC显著降低了嫁接接合部赤霉素GA15和GA8含量，而在嫁接后48和72 h，CCC显著提高了嫁接接合部赤霉素GA34和GA3含量；在嫁接后12、48和72 h，CCC处理显著提高了嫁接接合部反式-玉米素-9-B-葡萄糖苷(tZOG)和异戊烯腺嘌呤-9-葡萄糖苷(iP9G)含量，显著降低了嫁接接合部顺式-玉米素-D-核糖甙(cZR)和戊烯腺嘌呤核苷(IPR)(除嫁接后48 h)含量。因此，CCC处理促进番茄幼苗嫁接愈合进程中植物激素的积累，尤其是生长素水平的提高，有利于嫁接接合部维管束重连。

2.4 CCC对番茄嫁接苗生长影响

图5显示，嫁接后20 d，叶面喷施CCC处理的嫁接苗接穗叶片SPAD值和砧木根系活力分别比CK显著提高17.49%、20.20%，说明嫁接前叶面喷施CCC能显著促进嫁接苗的生长发育。

3 讨 论

GA通过促进细胞分裂和扩展在植物种子萌发和茎伸长、开花和果实成熟等方面起重要作用，还可调节植物环境适应能力[22]。矮壮素(CCC)作为GA抑制剂，广泛用于蔬菜集约化育苗生产中，CCC通过抑制贝壳杉烯合酶(KS)活性，使香叶基焦磷酸酯(GGPP)合成内根-贝壳杉烯过程受阻，抑制GA生物合成[23-24]，植株表现矮化，节间距缩短，叶色加深，还可增强植株抗逆性。外施IAA或GA3可抵消CCC处理对黄瓜下胚轴伸长的抑制效果[25]。Ji等[26]研究发现在番茄幼苗整个生长期，外施CCC处理导致茎和根GA合成基因表达下调，茎和根中GA含量降低，幼苗株高、下胚轴、茎粗和根长降低，而GA信号基因表达模式则在茎和根中相反，导致根粗增加。本研究发现，嫁接前叶面喷施CCC处理显著降低了番茄幼苗株高和茎粗，以及上胚轴长、地上部分鲜重等，显著抑制了番茄幼苗生长，砧木的表现更为明显，与前人研究结果一致。

同时，在嫁接愈合进程中，内源植物激素IAA、CTK和GA相互作用，能促进细胞分化，导致维管束形成，接穗和砧木完成重连。据报道，在嫁接后1～3 h，创伤响应诱导WIND1增强愈伤组织形成处的CTK响应；在嫁接后3～72 h，接合部上方和下方呈非对称表达模式，IAA和CTK分别在嫁接接合部上方和下方积累，GA在嫁接接合部上方和下方发挥作用，诱导愈伤组织形成和维管组织分裂；嫁接后96～240 h为恢复对称期，木质部和韧皮部发生重连，植株基本愈合，开始次生生长[15, 27-28]。Cui 等[15]在番茄嫁接切割后，于接合面涂抹一定浓度的IAA、6-BA以及二者混合物，验证了IAA和CTK促进接合部木质部和韧皮部连接。Zhai等[29]利用根部特异性表达生长素合成基因iaaM的烟草作为砧木，可提高野生型接穗IAA水平，导致嫁接接合部更快形成愈伤组织，加快愈合进程；砧木中过表达生长素失活基因iaaL则延缓嫁接愈合。CCC处理对植株的抑制效应不仅是抑制GA的合成，还影响了其他内源植物激素含量。在马铃薯叶面喷施CCC后，其植株叶片IAA和ZT含量显著提高，果实产量和品质增加[23]。在本试验嫁接愈合进程中，番茄幼苗叶面喷施CCC处理降低了嫁接接合部GA15和GA8含量，提高了嫁接接合部TRP、MEIAA、TRA、IAA、tZOG和iP9G含量。研究表明IAA可通过调节GA生物合成调节植株生长发育，其他植物激素也可调节GA生物合成[30]。Matsuoka等[13]发现在拟南芥下胚轴嫁接愈合进程中，GA含量升高，外施GA合成抑制剂多效唑(PBZ)处理可促进维管组织细胞分裂，外施GAs或TIBA则下调了GA合成氧化酶基因GA20ox1表达，说明IAA可通过影响GA生物合成调节维管束重连和皮层细胞扩张。而本试验中，在嫁接后72 h，CCC处理还提高了嫁接接合部GA34和GA3含量，可能由于生长素含量的提高而调节GA3生物合成，而GA3诱导蛋白酶体泛素化降解DELLA蛋白，随之释放光敏色素响应因子(PIF4)诱导依赖TRP的IPA途径合成IAA，促进了嫁接接合部IAA积累。总的来说，在番茄嫁接愈合进程中，嫁接前叶面喷施CCC处理能促进嫁接接合部生长素和细胞分裂素的积累。与CK相比，嫁接前叶面喷施CCC处理的番茄嫁接成活率无差异，均为100%。本研究中，番茄嫁接后72 h，CCC处理的幼苗嫁接接合部已可见木质部导管分子连接，早于对照；嫁接后96～120 h，CCC处理的嫁接接合部木质部导管分子与韧皮部基本完成连接，愈伤组织薄壁细胞填满接合部间隙。另外，嫁接后72～168 h，CCC处理的嫁接接合部维管束品红吸收含量和平均荧光强度高于CK。综合而言，CCC处理促进了嫁接愈合期接合部木质部和韧皮部重连，且促进嫁接苗的生长发育。

综上所述，叶面喷施CCC处理抑制了番茄幼苗生长，降低了番茄嫁接接合部赤霉素含量，提高了生长素和细胞分裂素含量，嫁接接合部木质部和韧皮部连接早于对照。因此，番茄幼苗嫁接前叶面喷施CCC处理可促进维管束重连和嫁接苗生长发育。