蔡海滨++涂敏等

摘 要 针对常规石蜡切片方法无法制得橡胶树木质部切片的问题，优化了橡胶树木质部切片制作方法并进行了验证评估。以3龄和30龄的橡胶树木材为材料，经FAA固定、乙醇预处理后，增加了以冰醋酸软化木质部这一步骤，用正丁醇取代二甲苯进行组织透明，其余步骤参考常规方法。结果表明，优化的石蜡切片方法可制作出完整、高质量的木质部切片，其木纤维的长度、宽度与硝酸离析所得到的木纤维一致度高，为橡胶树成龄木材的解剖学研究提供了方法。

关键词 橡胶树 ；木质部 ；石蜡切片 ；木纤维

分类号 S794.1

An Improved Method for Paraffin Section Preparation of Hevea Xylem

CAI Haibin TU Min HU Yanshi

CHENG Han AN Zewei HUA Yuwei HUANG Huasun

（Rubber Research Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree /

State Center for Rubber Tree Breeding， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract In this paper， we improved and evaluated paraffin section method of Hevea xylem compared to the conventional method. 3-year-old and 30-year-old rubber tree woods were collected， fixed in FAA， pretreated by ethanol， softened by acetic acid and transparentized by n-butanol replacing xylene. The remaining steps referenced conventional method. The result indicated that the improved method could produce complete， high quality paraffin section of Hevea xylem. The length and width of wood fiber by paraffin section had high consistency with those obtained by nitrate segregation， which provided a method for the study of mature Hevea wood anatomy.

Keywords Hevea brasiliensis ； xylem ； paraffin section ； wood fiber

中国位于太平洋西岸，海南和广东等沿海地区橡胶生产经常遭受台风的严重危害[1]。据统计，1951～1990年间，热带风暴和台风在海南登陆共62次，平均每年1.55次[2]。解决橡胶树的抗风问题是这些地区橡胶树栽培与持续高产、稳产的重要措施之一。研究表明，橡胶树风害是各种生物和非生物因子的综合作用结果。与弱抗风品种相比较，抗风品种木材纤维较粗短、壁较薄、腔径较大[3-4]。因此，橡胶树木质部石蜡切片制作在橡胶树抗风因子研究中非常重要。

石蜡切片（paraffin section）技术被广泛应用于细胞生物学、组织学、发育生物学和病理学等领域[5]，常应用于动、植物标本的组织形态学观察、细胞结构学观察、特定组织蛋白免疫组化、原位杂交及原位PCR 等，使细胞组织的形态观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，又从定性转向定量计测[6]。常规石蜡切片的制作过程包括石蜡组织块制作、切片制作和染色，具体的制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→染色→封固。其中的每一个环节都是相互关联，任何一个环节若不按规范操作，都会影响最终制片的质量[7]。然而，在众多组织中，以高大乔木的木质部为材料制作石蜡切片尤为困难。笔者在总结前人研究的基础上，通过长期的摸索，改进了常规石蜡切片制作方法，使得30龄的橡胶树木质部组织也能被制作出高质量的切片。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供试植物材料为3龄和30龄的橡胶树品种PR107，由国家橡胶树种质资源圃提供。分别选取距地面1 m处的树干，各3次重复。

1.1.2 试剂及仪器

试剂包括切片石蜡、二甲苯、FAA固定剂、冰醋酸、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、正丁醇、番红染液、硝酸、铬酸、结晶紫、树胶等；主要仪器：LEICA RM2235切片机、LEICA DMLB显微镜。

1.2 方法

1.2.1 常规石蜡切片方法制作橡胶树木质部切片[8-9]

在橡胶树木材处（距离木材韧皮部3～5 cm）切取约0.5 cm×1 cm×1 cm（横×弦×径向）的样品木材小块 → FAA固定液固定 → 80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→二甲苯Ⅰ（1 h）→二甲苯Ⅱ（1 h）→二甲苯Ⅲ（1 h）→二甲苯/石蜡（V∶V=1∶1）（65℃，48～72 h）→石蜡Ⅰ（65℃渗蜡4 h）→ 石蜡Ⅱ（65℃，4 h）→石蜡Ⅲ（65℃，4 h）→包埋→切片（10 μm）→贴片→展片→番红染色（30 min）→ 显微观察。

1.2.2 优化的石蜡切片方法制作橡胶树木质部切片[10-12]

取材→固定液固定→80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→冰醋酸（36～48 h）→冰醋酸/无水乙醇（V∶V=1∶3，1 h）→无水乙醇（1 h×3次）→ 100%乙醇/正丁醇（V∶V=1∶1，1 h）→ 正丁醇Ⅰ（2 h）→正丁醇Ⅱ（2 h）→正丁醇Ⅲ（2 h）→正丁醇/石蜡（V∶V=1∶1，65℃，12～16 h），后续步骤与常规方法一致。

1.2.3 优化的石蜡切片制作方法有效性验证

在橡胶树木材（距离木材韧皮部3～5 cm）处切取1 cm×1 cm×1 cm（横×弦×径向）的样品木材小块；从样品木材小块上切下纵向1 cm长的火柴杆粗细的小棒，3次重复；采用硝酸离析法[13-15]对木质部纤维进行结构解剖，用0.10 kg/L铬酸与10%（φ）硝酸（V∶V=1∶1）的混合液离析木材小棒4～5 d；离析后的材料经水清洗、系列乙醇脱水、0.01 kg/L的结晶紫染液染色、 二甲苯透明、树胶封片后，在光学显微镜下观察，拍照测量木纤维的长度与宽度。

2 结果与分析

2.1 2种方法的木质部切片结果比较

用常规的石蜡切片方法，无法获得完整的3龄和30龄的橡胶树木质部切片（图1-A），主要表现在：（1）切片时，石蜡与木质部脱离；（2）木质部脱水后硬且脆，容易破碎；（3）脱蜡染色时，木质部发生卷曲、脱落。而优化的石蜡切片方法可以制作3龄幼树和30龄老树完整、高质量的木质部石蜡切片，能清晰观察到细长的木纤维细胞以及紧密排列在四周的木射线细胞（图1-B和图1-C）。

2.2 优化法与硝酸离析所得木纤维比较

用硝酸离析后得到的木质部，经显微观测可清晰见到分散的木纤维细胞（图1-D）。分别测量优化法和硝酸离析所得到木纤维的长度与宽度，通过DPS数据比较发现，优化的石蜡切片中9份实验材料的木纤维长度均小于硝酸离析所得的木纤维长度，但二者差异不显著（图2），二者木纤维宽度的数据差异也极小（图3）。

3 讨论

橡胶树木质部石蜡切片制作的质量直接关系到木纤维观测的准确性，进而影响橡胶树木材特性的研究。通过3龄和30龄的橡胶树品种PR107木质部石蜡切片制作，结果发现，常规的植物石蜡切片方法不能用于制作橡胶树木质部石蜡切片，因此，笔者对其进行了改进，主要包括：（1）增加醋酸软化这一步骤，通过醋酸38 h的软化，橡胶树木质部组织变得松软，容易浸蜡，利于顺利完成切片，大大少于树芯切片的软化时间[于70%乙醇与甘油的混合液（V∶V=1∶1）中进行软化，软化时间需大于1周][16]；（2）用正丁醇取代二甲苯作为透明剂，二甲苯气味难闻且有毒，用正丁醇替换既保证了实验效果，同时比较环保，对人体伤害小；（3）优化了橡胶树木质部组织脱水、软化、透明和浸蜡等步骤的处理时间，使木质部石蜡制片的效果达到最佳。结果发现石蜡切片的木纤维长度均小于硝酸离析所得的木纤维长度，主要原因是石蜡切片中的木纤维相互交错，起始点与终止点较难准确把握。本研究通过对常规石蜡切片方法的改进，制出完整、优质的橡胶树木质部切片，不仅为橡胶树成龄木材的解剖学研究提供了方法，同时也为其它高大乔木木质部的研究奠定了基础。

参考文献

[1] 黄宗道. 热带北缘橡胶树栽培[M]. 广州：广东科技出版社，1987.

[2] 黄华孙. 中国橡胶树育种五十年[M]. 北京：中国农业出版社，2005.

[3] 郑兴峰，邱德勒，陶忠良，等. 巴西橡胶树不同抗风性品系木材胞壁纤丝角[J]. 热带作物学报，2002，23（1）：14-18.

[4] 付志一，焦群英. 植物细胞力学模型研究进展[J]. 力学进展，2005，35（3）：404-410.

[5] 何凤仙. 植物学实验[M]. 北京：高等教育出版社，2000：25.

[6] 丘安经. 植物学实验指导[M]. 广州：华南理工大学出版社，2003：121.

[7] 侯春春，徐 水. 浅析影响石蜡切片质量的关键因素[J]. 中国农学通报，2009，25（23）：94-98.

[8] 施恩青. 改良与常规石蜡切片方法在切片质量方面的比较[J]. 齐齐哈尔医学院学报，2014，35（16）：2 442-2 443.

[9] 杨捷频. 常规石蜡切片方法的改良[J]. 生物学杂志，2006，23（1）：45-46.

[10] 帅焕丽，杨途熙，魏安智，等. 杏花芽石蜡切片方法的改良[J]. 果树学报，2011，28（3）：536-539，552.

[11] 毛晓霞. 石蜡切片制作方法的改良[J]. 安徽农学通报，2013，19（8）：15-16，39.

[12] 李 璐. 石蜡切片制作的注意事项[J]. 临床合理用药杂志，2012，5（3）：107-108.

[13] 徐 茜，陈亚宁. 胡杨茎木质部解剖结构与水力特性对干旱胁迫处理的响应[J]. 中国生态农业学报，2012，20（8）：1 059-1 065.

[14] 史刚荣，王旭明，张 铮. 安徽黄山华中五味子次生木质部的生态解剖[J]. 广西植物，2007，27（2）： 161-166.

[15] 郑兴峰，陶忠良，邱德勃，等. 巴西橡胶树抗风品系木材纤维的解剖特征[J]. 华南农业大学学报（自然科学版），2003，24（1）：47-49.

[16] 张军周，勾晓华，赵志千，等. 树轮生态学研究中微树芯石蜡切片制作的方法探讨[J]. 植物生态学报， 2013，37（10）：972-977.