张 瑞，唐 红*，何丽霞

(1 甘肃农业大学 林学院，兰州 730070；2 甘肃省牡丹工程研究中心，兰州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)属芍药科芍药属树种，主要分布于甘肃南部、陕西南部和四川北部等地区，因其花瓣基部有一个明显的紫斑而得名[1]。紫斑牡丹植株高大、花色鲜艳、香味浓郁、抗旱耐寒，既是观赏植物，又是药用和食用的名贵花卉[2]。紫斑牡丹品种群由野生的单瓣花经过不断的自然进化，具有以雄蕊瓣化为主的半重瓣、重瓣、极重瓣等丰富的花型，且在同株紫斑牡丹中既有单瓣花型又有重瓣花型。

花芽分化是有花植物生长发育过程中最重要的阶段，影响着植物开花的数量和质量,花芽分化过程由环境因子和内源激素共同调控，其中，内源激素是影响花芽分化的重要因素。因而研究紫斑牡丹花芽分化过程对其花期调控及栽培有重要意义[3]。目前，对紫斑牡丹花芽的研究多集中在花芽分化形态及分化时间上。王莲英[4]通过观察形态进程得出，牡丹的芽为混合芽，生长到一定程度形成花芽，牡丹品种的花芽分化一般始于6月上旬，结束于9月下旬至10月中旬；贺丹等[5]研究结果显示，牡丹品种‘凤丹’花芽分化开始于6月初，结束于9月中旬，总共100 d左右；董晓晓等[6]通过蒽酮比色法测定发现，牡丹花芽分化过程中叶片可溶性糖含量的变化为先升高后下降，而淀粉质量分数刚开始保持平稳，8月初开始下降。

花芽分化是植物由营养生长转向生殖生长的重要标志，包含着许多复杂的化学变化，内源激素的变化是花芽分化的关键[7]。前人研究表明，GA3能够抑制果树的花芽分化，ABA、CTK和乙烯能加快花芽分化，而IAA对花芽分化的作用不太一致[8]；果树成花取决于多种激素之间的一种平衡关系[9]，高CTK/GAs比值有益于开花[10]。目前，国内外对紫斑牡丹的形态解剖学、组织培养和细胞学等方面的研究已有一些报道，但对同株紫斑牡丹单、重瓣两种不同花型的花瓣形态结构、花芽分化及分化过程中内源激素含量变化的研究较少。为进一步认识紫斑牡丹成花机制，本研究通过调查同株紫斑牡丹‘关公红’不同花型的开花期，对比同株紫斑牡丹单、重瓣花型的花器官形态分化差异，测定其花芽分化各个时期内源激素的含量，并分析内源激素变化与不同花型的关系，为同株紫斑牡丹不同花型开花的化学调控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本试验于2020年6月上旬至2021年1月中旬进行，选取于甘肃省兰州市榆中县官滩沟牡丹园生长健壮、花枝发育良好的同株紫斑牡丹‘关公红’品种为研究材料。

1.2 实验方法

2020年6月上旬至下旬，观察并调查紫斑牡丹单、重瓣花型的开花期，选取成熟单瓣、重瓣的花瓣在专用电镜固定液中固定，后经梯度脱水干燥，经MSP-1S型离子溅射仪喷金后，于型号为S-3400N扫描电镜下观察拍摄花瓣的超微结构。

2020年7月上旬至10月下旬，每10～15 d剪取适量紫斑牡丹花芽，带回实验室。通过石蜡切片观察花芽分化的材料剥除外层芽鳞，用FAA固定，固定72 h后脱水包埋，切片机切片，切片厚度8～10 μm，番红-固绿染色，中性树胶封片，切片在显微镜下观察并拍照；用于测定内源激素的材料装冰盒带回实验室，各分3次称取 ‘关公红’单瓣、重瓣花芽，每次0.5 g，用锡箔纸包好，-70 ℃超低温冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定花芽分化期生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)等4种内源激素的含量。所使用的试剂盒选购于上海酶联生物科技有限公司，依照说明书进行相应的操作。

1.3 数据处理

所有实验数据均采用Excel 2019进行数据整理和汇总，采用SPSS和Origin 2019统计分析软件对数据进行方差分析和作图，单因素方差分析采用Anova分析法，检验水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 单瓣和半重瓣紫斑牡丹花器官形态学比较

通过花期调查可知，‘关公红’花紫红色，花药多，花丝粉色或红色，基部色斑大，黑色，斑缘辐射状，花瓣内侧斑块形状为卵形。其中，‘关公红’单瓣花朵在6月2日进入初花期，6月10日进入盛花期，6月23日进入末花期，花期为21 d左右；在盛花期所测得单瓣花花径在123.61～127.34 mm之间(图1，a)，花瓣数10，雄蕊多，内侧斑块的白色中肋明显(图1，c)。‘关公红’重瓣花朵在6月11日进入初花期，6月17日进入盛花期，6月26日进入末花期，花期为15 d左右；在盛花期所测得重瓣花花径在135.06～139.34 mm之间(图1，b),花瓣总数21，瓣化花瓣数11，雄蕊较多，内侧斑块没有白色中肋(图1，d)。进一步比较‘关公红’单瓣花瓣和重瓣花瓣表面形态超微结构发现，正常花瓣表皮细胞表面光滑平整无明显褶皱(图1，e)，而‘关公红’瓣化花瓣的表皮细胞表面有明显的褶皱(图1，f)。

2.2 单瓣和重瓣紫斑牡丹花芽形态分化比较

牡丹花芽为混合芽，试验观察结果表明，紫斑牡丹‘关公红’单、重瓣花朵的花芽分化顺序均可分为6个时期，即花芽分化初期、苞片原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，但重瓣花朵的分化时期始终早于单瓣花朵(图2)。其中，紫斑牡丹在花芽分化初期主要是叶原基的形态分化，顶端生长点逐渐向上凸起(图2，a)，叶原基在生长点周围呈螺旋状。根据生长点的状态来看，‘关公红’重瓣花芽分化要早于单瓣(图2，a、g)；在苞片原基分化期时，生长点慢慢下凹，逐渐变平变大，在其四周形成苞片原基，代表着花芽分化由营养生长向生殖生长转变(图2，b、h)；重瓣花朵苞片原基分化始于7月28日，单瓣花朵在8月2日开始分化苞片原基。在萼片原基分化期，花芽的顶端生长点更加下凹，在苞片原基内部形成萼片原基，萼片原基呈指状(图2，c、i)。重瓣花(8月15日)也比单瓣花(8月20日)更早进入萼片原基分化期。之后，花芽的顶端生长点进一步下凹，沿托盘内侧产生花瓣原基，外轮大，内轮小，呈现圆形(图2，d、j)。重瓣花花瓣原基分化始于8月28日，单瓣花朵在9月8日开始分化花瓣原基，且重瓣花形成的花瓣原基比单瓣花大。此后生长点进一步下凹，变深，产生若干颗粒状突起，从而形成雄蕊原基，此时为雄蕊原基分化期(图2，e、k)。重瓣花雄蕊原基分化始于9月12日，单瓣花朵为9月26日。与单瓣花相比，重瓣紫斑牡丹的雄蕊原基彼此分离且存在异化；雄蕊原基在不断生长，在花托盘底部出现较大的圆形突起，形成雌蕊原基(图2，f、l)。重瓣花雌蕊原基分化始于9月28日，而单瓣花朵在10月5日进入雌蕊原基分化期。

2.3 同株紫斑牡丹单、重瓣花朵花芽形态分化期内源激素含量的变化

测定结果(图3)显示，在紫斑牡丹花芽分化过程中，单、重瓣花朵花芽中IAA和ABA含量远高于GA3和ZR的含量，各激素含量随着花芽分化时期的变化趋势不尽相同。

首先，同株紫斑牡丹单瓣和重瓣花芽中GA3含量较低，在花芽分化初期，单瓣花芽中GA3含量又低于重瓣花芽；随着花器官的不断发育，单瓣花芽中GA3含量在萼片原基形成时显著增加(P<0.05)，表现为先升后降再升的变化趋势，并分别在萼片原基分化期和雌蕊原基分化期达到峰值，且显著高于其他时期；同时，重瓣花芽中GA3含量表现出先降后升的变化趋势，在花瓣原基分化期GA3含量最低，而后显著上升，在雄蕊原基形成时达到最高值(图3，A)。由此可推测低浓度的GA3有利于单瓣、重瓣紫斑牡丹花芽分化的启动，GA3含量的增加有利于单瓣花原基分化。

其次，图3，B显示，同株紫斑牡丹单、重瓣花芽中IAA的含量在花芽分化初期都处于较高水平，分别达到220和130 ng/g，而单瓣花芽明显高于重瓣花芽；随着花芽分化的启动，重瓣紫斑牡丹IAA的含量开始缓慢减少，在花瓣原基形成时IAA的含量达到最小值；而单瓣紫斑牡丹的IAA含量显著下降(P<0.05)，在苞片原基形成时出现最低值70 ng/g，这表明较低浓度的IAA有利于紫斑牡丹花芽分化。

再次，在紫斑牡丹花芽分化初期，单瓣、重瓣花芽中ABA含量分别为130和150 ng/g，随着苞片原基的形成，单瓣花的花芽中ABA含量显著下降(P<0.05)。在花瓣原基形成时重瓣紫斑牡丹花芽的内源ABA含量最高，最高浓度达到190 ng/g(P<0.05)，说明高浓度的ABA可能促进紫斑牡丹重瓣花原基的形成；紫斑牡丹单瓣花朵的内源ABA浓度在苞片原基形成时降到最低值(60 ng/g)，之后又开始回升(图3，C)。

另外，紫斑牡丹单瓣、重瓣花朵的花芽内源ZR含量水平都比较低，但随着花芽分化的进行，单瓣紫斑牡丹花芽的内源ZR含量先不断下降，在苞片原基分化期出现最低值(6 ng/g)，然后不断升高，在萼片原基形成时达到最大值(12 ng/g)；重瓣紫斑牡丹花芽的内源ZR含量不断在增加，于花瓣原基形成时达到最大值(17 ng/g)，随后在雄蕊原基分化期与雌蕊原基分化期ZR含量小幅下降(图3，D)。

2.4 同株紫斑牡丹单、重瓣花朵花芽形态分化期内源激素比值变化

花芽分化是多种激素相互作用、综合调控的结果，分析花芽形态分化期内源激素比值变化趋势有重要意义。首先，在紫斑牡丹花芽生长锥形成时，由于花芽中的IAA含量很高，ZR含量很低，花芽中的ZR/IAA的值比较低。随着花器官的进一步分化，重瓣‘关公红’花朵ZR/IAA呈上升趋势，在花瓣原基形成时达到最大值；而单瓣‘关公红’花瓣ZR/IAA的变化趋势呈先上升再下降最后上升的趋势，在花芽分化初期达到最低值(图4，a)。其次，单瓣‘关公红’花朵ZR/GA3值在花芽分化初期达到最大值，随后呈下降趋势，在萼片原基形成时达到最小值，随后又缓慢增加，于雄蕊原基分化期又出现一个小峰值，随后又开始下降；而重瓣‘关公红’花朵ZR/ GA3值在苞片原基分化期急剧增长，于萼片原基形成时达到最大值(图4，b)。由此推测提高ZR/ GA3值有利于重瓣‘关公红’花芽分化。再次，由于单瓣‘关公红’花芽中ABA含量在苞片原基分化期减少，所以ABA/GA3值急剧下降，随后又开始缓慢增加，在雄蕊原基形成时达到一个小峰值后又开始缓慢下降；而重瓣‘关公红’花芽中ABA/GA3值先不断增加，在花瓣原基分化期达到最大值(图4，c)。由于重瓣‘关公红’花芽在雄蕊原基形成时GA3的含量急剧上升，所以ABA/GA3比值最低，说明较低ABA/GA3值能促进紫斑牡丹‘关公红’重瓣花雄蕊原基的形成。此外，单瓣和重瓣‘关公红’花芽中ABA/IAA的变化趋势类似，均在花芽分化初期处于较低水平，后随着花芽不断地分化都开始增加。单瓣和重瓣花花芽的ABA/IAA值分别在萼片原基形成时和花瓣原基分化期先后出现最大值，它们在达到峰值之后均开始下降(图4，d)。另外， ‘关公红’花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA值总体表现为单瓣花高于重瓣花；单瓣花(GA3+IAA+ZR)/ABA比值在花芽分化初期达到最大，后随着花芽不断分化开始下降；而在重瓣花朵花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA比值基本趋于平稳状态，在花瓣原基形成时达到最小值(图4，e)。说明重瓣花在花瓣原基形成时消耗大量的GA3和IAA，(GA3+IAA+ZR)/ABA比值降低有利于重瓣花的花瓣原基形成。最后，单瓣‘关公红’花芽启动分化后，其花芽GA3含量显著增加，因而其 (IAA+ZR)/GA3比值在分化初期急剧下降，并且达到最小值，随后开始缓慢增加；重瓣‘关公红’花芽在雄蕊原基形成时(IAA+ZR)/GA3比值达到最小值，由此推测重瓣花在雄蕊原基分化期消耗更多的内源IAA和ZR(图4，f)。

3 讨 论

3.1 单、重瓣紫斑牡丹花器官比较

前人研究中发现影响花瓣表皮细胞性状的重要因素为花瓣材质[11]，如蝴蝶兰花瓣的材质不同，其表皮细胞形态也有差异[12-13]。本研究发现，紫斑牡丹花瓣的表面细胞排列致密，内部细胞结构呈狭长形，正常花瓣表皮细胞表面光滑平整无明显褶皱，而重瓣花瓣化花瓣的表皮形态有明显的褶皱，造成不同的原因可能是重瓣‘关公红’瓣化的花瓣是由雄蕊变异而来，跟正常花瓣来源不同、材质不同。紫斑牡丹花芽分化是有花植物生长发育重要阶段，研究牡丹花芽分化机理对牡丹栽培与花期调控具有重要意义。在本研究中，不管是紫斑牡丹单瓣花朵还是重瓣花朵，都依次经历了花芽分化初期、苞片原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期，不同花型的紫斑牡丹分化时间及花器官结构存在一定的差异。重瓣花有较多的瓣化雄蕊，所以花瓣较多，演化程度较高，但重瓣花的花芽分化时间明显早于单瓣紫斑牡丹，花瓣原基的体积也明显增大。与单瓣花相比，重瓣紫斑牡丹的雄蕊原基彼此分离且存在异化，这可能与重瓣花中雄蕊瓣化有关系。此外，紫斑牡丹花芽分化是一个非常复杂的过程，花芽分化的形态规律不仅取决于紫斑牡丹自身的遗传特性，而且还会受到外界环境的影响。

3.2 内源激素对紫斑牡丹单、重瓣花朵的花芽分化的调控

植物花芽分化与体内各类激素水平密切相关，不同阶段激素水平及激素平衡对植物成花和花序构建起重要作用[14]。研究表明，植物激素通过调控核酸、蛋白质、酶活性等代谢过程进而调控花芽分化。赤霉素对花芽分化的作用比较复杂，高浓度的GA3可有效解除牡丹芽的休眠[15]。在拟南芥中，GA突变体的GA合成过程及信号传导受到影响，使得开花延迟[16]。前人研究表明GA3是一种抑制类激素[17-20]，GA3对葡萄、苹果、梨子、荔枝等的花芽分化具有抑制作用[21]。艾军等[22]研究进一步表明，较高浓度的赤霉素对五味子的花芽分化具有促雄抑雌的作用，再次证明赤霉素在花芽分化中的复杂性。在本研究的花芽分化过程中，同株紫斑牡丹单、重瓣花芽中GA3的含量都比较低，说明较低浓度的GA3能够促进单、重瓣紫斑牡丹的花芽分化。

同时，IAA是影响植物成花的重要激素之一，但关于IAA与植物成花的关系一直存在争议。有观点认为IAA可以抑制花芽分化，在大樱桃的研究中发现，IAA含量在花芽分化初期较低，花芽分化后期有所增加，并且花芽中IAA的浓度低于叶芽，所以认为IAA抑制花芽分化[16]；同时，勒杜鹃在开花之前必需较低浓度的IAA[23]。也有研究表明，生长素对花芽分化的影响并非生长素本身所起的作用，而是通过结合其他内源激素共同影响花芽分化进程。本研究中，内源激素IAA在两种花型紫斑牡丹花芽分化初期均大量积累；之后，单瓣花芽中的IAA含量在苞片原基形成时显著下降，而在花芽分化后期含量逐渐上升，推测与IAA在花芽分化不同阶段作用不同有关，同时说明单瓣花苞片原基形成时无需更多的IAA；重瓣‘关公红’花芽中IAA含量在此过程中则呈缓慢下降趋势，并保持在较低水平，在花瓣原基分化期达到最低值。

ABA是一种促进成花的内源激素，前人发现ABA能打破百合鳞茎休眠，启动花芽分化[24]；李雯琪等[25]也报道，较高浓度的ABA有利于单重瓣榆叶梅花芽分化。本实验发现，单瓣和重瓣‘关公红’花瓣ABA含量在花芽分化初期都比较高，单瓣‘关公红’ABA含量在萼片原基形成时有所下降，而在花瓣原基分化期显著提高；重瓣‘关公红’ABA含量在整个花芽分化过程中都保持较高水平，证明在花芽分化过程中ABA的积累有利于紫斑牡丹重瓣花朵的花芽分化。另外，重瓣‘关公红’ABA含量在花瓣原基分化期达到最大值，此时重瓣花的花瓣原基较单瓣花的大，又说明高浓度的ABA能更加促进重瓣花原基的发育。

ZR是植物内存在的一种细胞分裂素，主要产生于植物根部，促进核酸和蛋白质在植物体内的积累。前人研究表明，高水平的ZR能够促进陆地棉成花诱导[26]、野生萱草花器官组织生长[27]以及膏桐花梗、花柄和小花的伸长[28]。ZR对植物花芽分化起促进作用，如花芽生理分化期高浓度的ZR有利于大樱桃花芽的形成[16]。在本实验中，单瓣和重瓣‘关公红’花瓣的ZR含量在花芽分化过程中均也不断升高，说明ZR含量的增加有助于紫斑牡丹的花芽分化。

3.3 多种激素平衡对单、重瓣紫斑牡丹花芽分化的影响

有关内源激素与植物分化的关系研究发现，激素间平衡也起到促进成花或抑制成花的重要调控作用[29-30]。有研究表明，ABA/IAA、ABA/GA3值降低和GA3/IAA值升高，有利于花芽从营养生长向生殖生长转变[31-33]，ZR/GA3值升高可促进花芽形态分化和花粉粒的形成[34]。曹尚银等研究表明，在苹果花芽分化中，提高ABA/IAA、ZR/IAA、ZR/GA3的比值，有利于苹果成花率的提高[35]。前人在研究不同木本植物花芽分化发现，较高的ABA/IAA、ZR/IAA、ABA/GA3比值有利于花芽分化的进行[36]。本研究发现，较高的ZR/IAA、ABA/IAA比值对单瓣、重瓣花紫斑牡丹的花芽分化均有促进作用；提高ZR/GA3、ABA/GA3比值对重瓣花的花芽分化亦有促进作用；紫斑牡丹重瓣花的花芽中(GA3+IAA+ZR)/ABA比值在花瓣原基分化期显著下降，该比值的降低可能促进花瓣原基形成，而(IAA+ZR)/GA3比值减小则有利于重瓣花雄蕊原基的形成。