金慧慧

温州市龙湾区疾病预防控制中心（温州 325024）

参照现行有效标准GB 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》，在试验中发现，在254 nm下柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红都能得到明显的响应值，唯独亮蓝响应值低且难以分离[1]。不仅如此，该方法前处理步骤复杂，而且试验回收率偏低，由于需要通过漏斗真空抽滤，考虑到漏斗和真空泵数量，不能同时大批量检测，已不能满足日常批量的食品风险监测任务。为此，有很多商家生产出聚酰胺小柱，可以批量高效富集并洗脱分离出合成色素，但其价格昂贵，聚酰胺粉洗脱时不能充分搅拌，柱容积也有限，很难一次将样品溶液全部上样，分批上样略显繁琐，且底面积小，遇到糖含量高的样品，比如果冻，提取后样品溶液里会出现一些絮状物质，离心后沉淀效果并不明显，在过SPE柱时，容易出现堵塞柱子的现象[2]。试验通过对样品前处理步骤、样品溶液净化及浓缩步骤的改变，提高亮蓝的回收率，同时通过自制聚酰胺小柱达到一次性全部上样、底面积大不容易堵柱、可重复利用并且可灵活选择聚酰胺粉填充量的效果。由于可以批量进行处理，所以极大地提高合成色素的检测效率，能够很好地满足实际工作的需要[3]，为批量检测饮料中亮蓝合成着色剂提供更快速、更经济、回收率更高的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、设备与试剂

1.1.1 仪器与设备

Waters I-class高效液相色谱仪（配PDA二极管阵列检测器，美国Waters公司）；AL204电子天平（d=0.1 mg，美特勒-托利多）；自制聚酰胺小柱（在30 mL romer免疫亲和上样专用柱内嵌合G3砂芯滤板，固定于固相萃取装置上，相当于G3漏斗的作用）；旋涡混合器（德国IKA公司）；水浴锅（上海精宏实验设备）；GM 0.5A隔膜真空泵（天津津腾实验设备）；0.22 μm针式滤膜（上海安谱公司）。

1.1.2 材料与试剂

亮蓝标准，北京海岸鸿蒙，编号GBW（E）100162，质量浓度1.0 mg/mL；乙酸、氨水、乙醇、甲酸、柠檬酸、聚酰胺粉（分析纯）；甲醇（色谱纯）；水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.2 色谱条件

色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；波长629 nm；流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；流动相：甲醇与0.02 mol/L乙酸铵溶液（梯度洗脱，见表1）。

表1 亮蓝测定的流动相梯度

1.3 标准曲线的配制

吸取1 mL亮蓝标准（1.0 mg/mL）于10 mL容量瓶中，用纯水稀释至刻度，即100 mg/L，再吸取此溶液配制成0.1，1.0，10.0，20.0和30.0 mg/L的标准曲线，相关系数为0.999 1。标准曲线第二点色谱图见图1。

图1 标准曲线第二点色谱图

1.4 样品处理方法

称取5 g样品放入25 mL烧杯中，含二氧化碳的样品加热去除二氧化碳，含乙醇的样品加热去除乙醇，试样pH偏高时用柠檬酸水溶液（20%）调节至pH 3左右，加入1.0 g聚酰胺粉置于60 ℃恒温水浴锅中，不断搅拌并保温0.5 h后取出。将烧杯中样品用10 mL水（pH 3，用20%柠檬酸溶液调节）一次性全部冲洗转移至自制聚酰胺小柱（见图2），弃去滤液，并用10 mL甲醇-甲酸（6∶4，V/V）、10 mL纯化水（pH 6～7）淋洗，通过真空泵吹干小柱，用20 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V，现用现配）分4次洗脱并接收滤液，收集液于100 ℃水浴锅蒸干，加乙酸调节pH至中性，用纯水定容至10 mL，在漩涡混合器上充分混匀后，过0.22 μm针式滤膜，待测。

图2 自制聚酰胺小柱

2 结果与讨论

2.1 聚酰胺粉吸附环境酸度的选择

亮蓝属于人工合成色素，是由苯甲醛邻磺酸与N-乙基-N-（3-磺基苄基）-苯胺经缩合、氧化而制得的，属于偶氮类化合物[4]。鉴于聚酰胺粉吸附原理是在酸性条件下酰胺键能以氢键形式结合质子，表面带着大量正电荷，容易吸附偶氮类合成色素在水中解离出的带负电荷的大阴离子，从而形成稳定化合物，根据GB 5009.35—2016《食品安全国家标准》中“试样pH偏高时用柠檬酸水溶液（20%）调节pH 6左右搅拌吸附”的操作，试验分别设计pH为3，4和6时，在矿泉水中分别加标10 mg/L亮蓝，进行加标回收率的比较。结果发现，pH 3时，亮蓝的加标回收率最高。

表2 不同pH下聚酰胺粉吸附能力的比较结果

2.2 聚酰胺粉用量的选择

聚酰胺粉用量也是影响吸附效果的关键之一，选择0.25，0.50，1.00和2.00 g聚酰胺粉分别对加标20 mg/L亮蓝的矿泉水进行加标回收率的比较，结果显示，聚酰胺粉1.00 g时就能达到和2.00 g时差不多的效果，故选用1.00 g聚酰胺粉进行吸附洗脱。

表3 不同质量聚酰胺粉的吸附能力的比较

2.3 60 ℃水浴恒温时长的选择

聚酰胺粉吸附还需时间活化，对此将水浴时长进行不同的设定，比较各时长的加标回收率，由此确定，最佳时长为30 min。

表4 不同水浴时长下聚酰胺粉的吸附能力的比较

2.4 淋洗液pH的选择

淋洗液pH分别为3，4和6时，比较亮蓝加标10 mg/L时的回收率。pH 3时，回收率为95.1%；pH 4时，回收率为87.0%；pH 6时，回收率为85.2%。由此确定，最佳pH为3。

2.5 洗脱液的选择

洗脱液主要有乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）与10%氨化甲醇2种，分别对2种洗脱液进行加标回收测试，结果显示矿泉水中加标20 mg/L亮蓝时，亮蓝乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）回收率为98.7%，10%氨化甲醇回收率达95.1%，乙醇-氨水-水的效果更好，且更安全。

2.6 方法检出限及精密度

按照该试验条件，方法的检出限（SLOD）和定量限（SLOQ）分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度计算[5]。结果显示，亮蓝0.100 mg/L的rSN为34.76，检出限为0.009 mg/L，定量限为0.03 mg/kg。对加标10 mg/L的矿泉水进行7次精密度测试，结果分别为9.91，9.87，9.88，9.91，9.92，9.90和9.92 mg/L，平均值为9.90 mg/L，回收率为99.0%，精密度为0.20%。

3 结论

通过线性、检出限、精密度等方法确认，此次试验所介绍的方法符合检验要求，回收率高，结果准确可靠，并且可以批量检测，节省检测时间和资源，可用于饮料中亮蓝合成色素的定量检测。