宁燕 罗康华 蒋催蓉 党荣敏 叶劲松 刘运麟

(1黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013;2黔南州人民医院病理科)

类风湿性关节炎(RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病〔1〕，RA在全球的平均发病率为1%，我国的发病率为0.2%～0.5%，患者的临床表现多为受累关节肿胀、疼痛及功能下降，如果不进行及时有效的治疗，约50%的患者在2年内会出现不同程度的关节畸形和功能受损，严重影响患者的生活质量〔2,3〕。RA发病机制十分复杂，研究发现〔4,5〕，血管内皮生长因子(VEGF)、三型酸敏感离子通道(ASIC3)参与了RA炎症、疼痛等过程，并在其中发挥重要作用。目前，RA治疗药物主要是糖皮质激素(GCs)、非甾体抗炎药(NASDs)等，但该类药物能够引起不良反应，对心血管造成一定风险〔6〕。随着RA治疗药物的不断研发，中医药以其副作用小，疗效好等特点展现了巨大的挖掘潜力。五香血藤〔7〕是贵州特色苗药，具有治疗关节炎、跌打损伤等骨科疾病等作用，然而，有关五香血藤治疗关节炎的动物实验研究未见报道，为此，本研究以胶原诱导关节炎(CIA)大鼠为模型，进一步探索苗药五香血藤提取物对VEGF、ASIC3表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与分组 成年SD大鼠60只，雌雄各30只，体重230～250 g，购自第三军医大学实验动物中心。将大鼠随机分为6组，空白对照组(正常组)，模型对照组(模型组)，地塞米松对照组(阳性药物组)，五香血藤提取物低、中、高剂量组，每组10只，雌雄各半，分笼喂养，每笼5只，自由取食，适应性饲养3 d。

1.1.2药物 五香血藤购自贵州都匀市中药材市场，并由广西师范大学化学与药学学院进行鉴定和质控，15 kg干五香血藤，粉碎，加入萃取釜中，用80 L 80%的乙醇萃取3次，得到浸膏1 200 g，将浸膏配制成10 mg/ml浓度的储备液备用。醋酸地塞米松片，辰欣药业股份有限公司，批号：国药准字H37021898；牛Ⅱ型胶原，美国Chondrex公司提供，批号：20022；完全弗氏佐剂(IFA)，美国Sigma公司提供，批号：20080301。

1.1.3主要试剂与仪器 大鼠血清VEGF及ASIC3酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购置武汉基因美科技有限公司；全自动酶标仪,型号：Victor X3，由美国Perkin Elmer公司提供。

1.2方法

1.2.1CIA大鼠模型制备 依据文献〔8,9〕，取2 mg/ml牛Ⅱ型胶原乙酸溶液与等体积完全弗氏佐剂配成1 mg/ml胶原乳剂备用。将0.2 ml胶原乳剂注入每只大鼠的右后足及背皮内，1 w后，采用同样的方法进行第2次免疫，每只大鼠的右后足及背皮内注射剂量为0.1 ml。第2次免疫后开始计算各实验组大鼠关节炎症指数(AI)，AI为4个关节肿胀评分总和，AI≥4即为造模成功。

1.2.2CIA炎症评分标准 大鼠的每个爪子最高评为4分，每只大鼠最高评为16分，AI具体标准如下〔10〕:0分=无关节红肿；1分=关节轻度红肿；2分=关节中度红肿；3分=关节重度红肿；4分=关节畸形或不能负重。

1.2.3足肿胀测量及计算 足肿胀度=造模后足趾厚度-造模前足趾厚度〔11〕，分别在造模前和给药后的第7、14、21、28天，使用游标卡尺对各组大鼠右后足趾进行足趾厚度测量,并进行炎症评分，直至给药结束。

1.2.4给药方案 第1次免疫14 d后，AI≥4分，造模成功，1 d后开始给药。药物剂量参考文献〔12〕进行确定，阳性药物组给予醋酸地塞米松灌胃，剂量，0.35 mg/kg；五香血藤提取物低、中、高剂量组灌胃剂量分别为63、126、252 mg/kg；模型组与正常组给予灌胃同体积的蒸馏水；各组大鼠给药次数为1次/d，连续给药28 d。

1.2.5取材与组织处理 于末次给药结束后2 h对大鼠进行相应处理。先称取各组大鼠体重并记录，后股动脉取血处死大鼠：①取股动脉血，静置，离心，取上清液，在-20℃下保存待测。采用ELISA测定大鼠血清VEGF、ASIC3水平，操作严格按照试剂盒说明书进行；②取大鼠双踝关节及足爪，分离去除周围软组织及肌肉组织，放入4%的多聚甲醛固定，脱钙、水化、苏木素-伊红(HE)染色、透明、固定后，光镜下观察病理变化。

1.2.6测定脏器指数 待大鼠处死后，解剖取胸腺、脾脏等器官，滤纸吸干，称重，记录数据备用。脏器指数=脏器重量/体重×100%。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析及多重比较。

2 结 果

2.1各组右后足肿胀度比较 与正常组比较，各实验组足肿胀度较为明显(P<0.05)，给药不同时间，各药物组大鼠足肿胀度与模型组比较，均显著好转(P<0.05)，第14、21、28天，五香血藤提取物高剂量组与阳性药物组足肿胀度差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组关节总AI比较 模型组及各给药组第7、14、21、28天关节各AI显著高于正常组(P<0.05)。与模型组比较，阳性药物组及五香血藤提取物高剂量组第7、14、21、28天关节总AI显著降低(P<0.05)，五香血藤提取物低剂量组第14、28天及五香血藤提取物中剂量组第14、21、28天关节总AI显著降低(P<0.05)。在给药的第21天和28天，五香血藤提取物高剂量组与阳性药物组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 各组给药不同时间右后足肿胀度比较

表2 各组给药不同时间关节总AI比较分)

2.3各组血清VEGF、ASIC3水平比较 第28天给药结束后，与正常组比较，各实验组血清VEGF、ASIC3表达差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各药物组VEGF、ASIC3表达显著降低(P<0.05)；阳性药物组与五香血藤提取物高剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组血清VEGF、ASIC3水平比较

2.4各组脏器指数比较 与模型组比较，各给药组脾脏、胸腺指数差异显著(P<0.05)，与阳性药物组比较，五香血藤提取物中、高剂量组脾脏和胸腺指数差异不具有统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.5各组关节病理观察 正常组踝关节滑膜组织光滑完整，组织结构正常,滑膜细胞、软骨及骨组织中未见炎症细胞浸润及血管增生；模型组大鼠踝关节滑膜组织排列紊乱、增生明显，软骨组织破坏明显，在软骨面，还可见部分软骨细胞增生，周围组织中大量炎症细胞浸润，且组织水肿严重；五香血藤提取物低剂量组大鼠踝关节滑膜组织仍有较多炎症细胞浸润，但其浸润及组织水肿现象较模型组有所减轻；五香血藤提取物中剂量组大鼠踝关节滑膜组织及周围组织内可见炎症细胞数量减少，组织轻度水肿，其间少量新生血管及滑膜增生，软骨轻度增生，少数关节软骨破坏；五香血藤提取物高剂量组和阳性药物组大鼠踝关节均可见明显新生血管，滑膜组织病理状况明显改善，滑膜组织及周围组织内水肿明显缓解，仅可见少量的炎症细胞浸润，没有明显的软骨及骨组织的破坏，见图1。

表4 各组脏器指数比较

图1 各组踝关节病理(HE染色,×100)

3 讨 论

RA是一种慢性炎症反应，近年来，有关RA中药治疗的研究逐渐成为RA药物研发的热点。2015年，国务院办公厅发布《国务院办公厅关于印发中医药健康服务发展规划(2015-2020年)的通知》〔13〕，将中医药服务医疗、服务健康产业发展上升至国家发展层面，进一步深化医药卫生改革，促进全面健康。五香血藤为木兰植物长梗五味子的茎藤，是贵州常用的民间草药，具有活血消肿、理气止痛等功效，其主要活性成分为木脂素，具有抗肿瘤、抗氧化、安定等药理作用〔14〕。本研究结果表明，就CIA大鼠足关节外部形态而言，五香血藤提取物发挥了消除肿胀的作用。

VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，就目前研究得知为最强血管通透剂，能够促使内皮细胞分化和增生，使血管通透性增强，诱导血管翳的生成〔4，15〕。VEGF与RA关系研究认为〔16，17〕，VEGF对关节滑膜血管翳的形成具有特殊的影响作用，通过调控血管内皮细胞的增殖，形成新微生血管，使血管内物质渗出增加，血管通透性增强，进而导致炎症的进一步发展。刘春芳等〔18〕对风湿祛痛胶囊对CIA大鼠滑膜血管新生的影响进行研究，结果发现，CIA大鼠关节滑膜中VEGF含量明显增加，VEGF含量与CIA大鼠关节炎症呈正相关。本研究结果提示，五香血藤提取物能够对CIA大鼠关节的炎症因子发挥抑制作用。

ASICs是一类胞外H+激活的阳离子通道，属于阿米洛利敏感的上皮钠通道/退变素，超家族中的一员，在周围和中枢神经系统中具有广泛分布，与RA关系密切〔19〕。已研究发现〔20，21〕，ASICs能够促进RA关节组织中白细胞介素(IL)-1β等炎症细胞的分泌，参与组织酸化调控。其中3型，ASIC3在痛觉传导通路上广泛存在，在炎症环境中痛觉敏感形成发挥重要的生物学作用，是主要的酸感受器〔22〕。季庆辉等〔23〕对ASIC3 在膝关节骨性关节炎大鼠疼痛中的作用进行研究，结果发现，ASIC3与膝关节骨性关节炎大鼠继发性疼痛呈正相关。

胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官，胸腺、脾脏指数能够在一定程度上反映出机体的免疫水平〔24〕。胸腺能够产生胸腺细胞，胸腺细胞能够作为T淋巴细胞的后备细胞，以备T细胞不足之需，协助机体完成免疫调控。脾脏作为机体重要的淋巴器官，能够对有害微生物、肿瘤细胞等进行过滤，是机体特异性免疫反应的重要场所。本研究表明，五香血藤提取物能够对CIA大鼠发挥抗炎作用。

综上所述，高剂量五香血藤提取物能够通过抑制VEGF和ASIC3的表达，对CIA大鼠发挥较好的治疗作用，但RA发病机制尚未明确，五香血藤对其治疗作用机制还有待进一步挖掘。