杨文平 亓玉心 郑亮 刘长江 徐淑娜 周玉法

(济南市人民医院 1呼吸科，山东 济南 271100；2药剂科)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是癌症死亡的主要原因。研究发现，吸烟、饮食、环境和遗传因素等与肺癌发生密切相关〔1，2〕。肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC占所有肺癌80%～85%，是最常见的肺癌类型〔3〕。NSCLC恶性程度较高，发病隐匿，57%的患者在诊断时即为晚期。目前，手术切除和化疗是NSCLC最常用的临床治疗手段〔4，5〕，然而由于NSCLC转移率较高，患者诊断时常处于中晚期已无法接受手术治疗，Ⅳ期NSCLC 5年生存率不到1%〔6，7〕。雷公藤甲素(Tri)是从卫矛科植物雷公藤中提取的一种环氧二萜内酯化合物，又称雷公藤内酯或雷公藤内酯醇。Tri具有多种生物学活性，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗类风湿等作用，并且对老年痴呆也具有改善作用〔8，9〕。研究表明，Tri对多种癌症如胃癌、乳腺癌、粒细胞白血病及胰腺癌等具有良好的抗肿瘤活性〔10〕，宋岚等〔11〕报道Tri可促进NSCLC细胞系A549凋亡，然而其具体机制仍不清楚。本研究旨在探讨Tri通过抑制P21活化蛋白激酶(PAK)4通路抑制NSCLC的生长和迁移。

1 材料和方法

1.1细胞培养与处理 NSCLC细胞系A549购自ATCC，培养环境为37℃，CO2浓度5%。DMEM培养基中添加10%胎牛血清(FBS)，同时添加100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和1 mmol/L丙酮酸钠。细胞按照加入不同浓度Tri分为4组：0.0 μg/L Tri组、0.5 μg/L Tri组、2.0 μg/L Tri组及8.0 μg/L Tri组。细胞培养至对数期后转移至96孔板，在培养基中分别加入0.0，0.5，2.0和8.0 μg/L Tri培养24 h后进行相关细胞实验。

1.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法 对数生长期细胞重悬浮后接种于96孔板后培养基中加入不同浓度Tri 37℃培养24 h。每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)37℃孵育4 h，DESO溶解结晶，分光光度计检测538 nm处吸光值。

1.3AnnexinV-FITC染色 细胞外膜上磷脂酰丝氨酸通过AnnexinV染色研究细胞凋亡。将细胞接种于6孔板后用不同浓度Tri处理48 h，根据试剂盒说明书，将细胞重悬于AnnexinV结合缓冲液中，随后与AnnexinV-FITC共孵育15min，细胞转移玻璃皿底部，并由CellR荧光显微镜记录，以绿色细胞占细胞总数的百分比计算凋亡细胞的比例。

1.4肿瘤成球能力实验 细胞以每孔2×103密度接种于24孔板，在添加1%甲基纤维素的DMEM-F12半固体培养基培养10 d。培养基中添加对应浓度Tri，用相位差显微镜测量球体直径，并计算球体直径平均值。

1.5Western印迹 不同浓度Tri处理后，A549细胞以放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液裂解取全蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。电泳结束后，将蛋白质转移至甲醇预活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂牛奶室温下封闭1 h后加入一抗室温孵育2 h〔anti-GAPDH 1∶1 000，anti-PAK4 1∶500，anti-p丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)1∶500，anti-p蛋白激酶(RAF)1：1500，anti-p细胞外调节蛋白激酶(ERK)1∶500〕后4℃过夜。第2天，TBST洗涤后室温孵育辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗1 h，电化学发光(ECL)法化学发光显影，Quantity One 软件分析条带灰度值。

1.6迁移和侵袭实验 细胞迁移实验：细胞处理后转移至无血清培养基中培养12 h。Transwell上室加入基质胶，含有10%FBS培养基置于下层，上室中加入细胞悬浮液。37℃培养24 h后4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，随机选择8个视野计数。细胞侵袭实验步骤同上但不加入基质胶。

1.7统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1不同浓度Tri对NSCLC活性的影响 与0.0 μg/L Tri组24、48、72 h细胞活性比较，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri组均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度Tri对A549 细胞活性的影响

2.2Tri对NSCLC细胞凋亡和肿瘤成球能力的影响 DAPI染色结果显示，随着Tri处理浓度升高可见染色质固缩逐渐增多，说明凋亡细胞逐渐增多。见图1。与0.0 μg/L Tri组细胞凋亡率比较，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri组均显著上升，且呈剂量依赖性(均P<0.05)；与0.0 μg/L Tri组细胞成球直径比较，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri组均显著下降，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见图2、表2。

图1 不同浓度Tri对A549 细胞凋亡的影响(DAPI和Annexin V-FITC染色，×50)

图2 不同浓度Tri对A549 细胞成球直径的影响(×200)

表2 不同浓度 Tri 对 A549 细胞凋亡及细胞成球直径的影响

2.3Tri对NSCLC细胞侵袭和迁移能力的影响 与0.0 μg/L Tri组细胞侵袭和迁移数比较，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri组均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表3、图3。

2.4PAK4信号通路在Tri抑制NSCLC中的作用 与0.0 μg/L Tri组PAK4、p-MEK、p-RAF、p-ERK比较，0.5、2.0、8.0 μg/L Tri组均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05)。见表4、图4。

表3 不同浓度Tri对A549 细胞侵袭和迁移的影响个,n=6)

图3 不同浓度Tri对A549 细胞侵袭和迁移的影响(结晶紫染色，×400)

表4 不同浓度Tri对A549 细胞PAK4信号通路的影响

1～4：0.0 μg/L Tri组、0.5 μg/L Tri组、2.0 μg/L Tri组、8.0 μg/L Tri组图4 不同浓度Tri对A549 细胞PAK4信号通路的影响

3 讨 论

NSCLC主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌，是主要的肺癌类型，65%以上NSCLC患者诊断时已处于晚期或出现转移〔3，12〕。Tri是提取自传统中药雷公藤的活性成分，研究发现Tri具有较好的抗肿瘤活性〔13，14〕。

宋岚等〔11〕研究发现，Tri可显著抑制体外培养的A549细胞增殖并诱导其凋亡。磷脂酰丝氨酸是细胞膜的主要组分之一，在正常情况下位于细胞膜内侧，当细胞坏死或凋亡时，则迁移至细胞膜外侧。Annexin V是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与磷脂酰丝氨酸具有高度结合力。FITC标记的Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸，标记坏死或凋亡细胞〔15〕。同样AnnexinV-FITC染色结果显示，随Tri处理浓度升高磷脂酰丝氨酸荧光强度逐渐升高，说明细胞凋亡逐渐增多。肿瘤细胞由于没有接触抑制，在体外培养易形成肿瘤细胞球体，可作为肿瘤细胞生长的指标。研究报道Tri可抑制肺癌细胞Spc-A1侵袭〔16〕。

宋岚等〔11〕对Tri抑制A549增殖的研究认为，Tri通过降低Survivin和B细胞淋巴瘤(Bcl)-2表达并升高Fas表达是Tri诱导A549细胞凋亡的机制。PAK是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，PAK4是其中的代表性分子。PAK4被细胞外信号活化后，通过下游结合蛋白或激酶底物启动基因转录并调控肿瘤生长等生物学过程〔17〕。肖琴等〔18〕报道，PAK4在 NSCLC肿瘤组织中表达明显升高，且NSCLC患者血浆中PAK4浓度明显升高。

综上，Tri可通过抑制PAK4信号通路抑制NSCLC细胞增殖和转移，并促进其凋亡。