江祖炘 汪春秀 王跃

(1宜宾市第二人民医院 四川大学华西医院宜宾医院，四川 宜宾 644000；2四川省人民医院)

随着中国进入老龄化社会，关节软骨损伤的患者越来越多，特别是老年骨关节炎患者，关节软骨由于解剖原因自身无血管、淋巴组织，缺乏必要的营养供给，且成熟的软骨细胞再分化增殖能力差，所以一旦损伤后自我修复困难，进而可发展为骨关节炎，严重影响日常生活〔1，2〕。近年新兴的软骨组织工程技术，提供了一种解决传统关节软骨修复方法取材不足、增加创伤、远期效果不佳等问题的方法〔3，4〕。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合改良纤维蛋白凝胶和软骨细胞体外非接触共培养向软骨组织分化，获取优秀的种子细胞，同时可注射微创下修复关节软骨缺损的可能方法。

1 材料与方法

1.1主要试剂及方法 清洁级3～5 d SD大鼠乳鼠4只(四川大学华西医院动物实验中心)；L-DMEM培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，HyClone公司)；胰蛋白酶(Trypsin，GIBCO公司)；Ⅱ型胶原酶(GIBCO公司)；兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)；逆转录试剂盒、cDNA 试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒(DNA Marker)、绿如蓝低毒核酸(DNAgreen)染料、凝胶加样缓冲液均购自天根公司。

1.2SD大鼠股骨BMSCs的获取、培养、鉴定 取3～5 d SD大鼠乳鼠处死后，于超净工作台内，注射器吸取0.5 ml L-DMEM培养基用力冲洗股骨髓腔，将冲洗液反复吹散后转移至25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，传代，镜下观察，取第3代(P3)BMSCs复合支架后行苏木素-伊红(HE)染色及甲苯胺蓝染色。

1.3SD大鼠膝关节软骨细胞的获取、培养、鉴定 取3～5 d SD大鼠乳鼠处死后，于超净工作台内，获取股骨远端和胫骨近端关节软骨，将剪碎的软骨组织依次0.25%的胰蛋白酶及0.2%Ⅱ型胶原酶消化，离心后获取软骨细胞，将软骨细胞接种于25 cm2培养瓶中培养，置于37℃、5%CO2孵箱中培养，传代，镜下观察，取P1软骨细胞复合支架后行Ⅱ型胶原免疫组化染色、HE染色及甲苯胺蓝染色。

1.4改良纤维蛋白凝胶支架-细胞复合物制备 将P3 BMSCs加入0.9% NaCl配制的含50 mg/L的纤维蛋白原溶液，并使细胞悬液浓度为2×106/ml。再配制凝血酶复合液：凝血酶(50 μ/ml)、抑肽酶(0.2 mg/ml)、氨甲环酸(20 mg/ml)、氯化钙(40 mmol/L)。向24孔培养板中每孔先加入凝血酶复合液250 μl，再加入改良的纤维蛋白细胞悬液250 μl，然后放入37℃、CO2孵箱，3～5 min后，支架凝固成型。

1.5实验分组 将制备的凝胶支架-细胞复合物置于Transwell共培养系统中的下室，P1软骨细胞接种于Transwell共培养系统中的上室，BMSCs和软骨细胞体外按细胞数比例2∶1非接触共培养作为实验组(B组)；分别用第1代(P1)软骨细胞和P3 BMSCs按上述方法与改良纤维蛋白胶凝胶支架材料复合，分别体外培养作为阳性对照(A)组和阴性对照(C)组，调整细胞数量，使3组细胞-支架复合体内细胞总数相同。使用10%FBS 的L-DMEM培养基培养。

1.6样本采集及成软骨组织能力检测 标本大体观察及重量比较、HE和甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。阿利新蓝比色法检测蛋白聚糖(GAG)含量，RT-PCR法半定量检测Ⅱ型胶原mRNA表达检测。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件行LSD-t检验。

2 结 果

2.1BMSCs、软骨细胞倒置相差显微镜观察 原代BMSCs 48 h换液时见部分贴壁生长，呈不均匀状菌落分布，部分细胞边缘出现突起，长短粗细不一，可见梭形状、少量多角形细胞，传代生长过程中细胞形态逐步相同，胞质内颗粒增多(图1)。原代软骨细胞未贴壁时呈球形，约1 d后完全贴壁，传代后5～6 h即可见贴壁生长，4 d左右即可完全长满培养瓶，细胞片状增殖，可见典型软骨细胞“蜂巢”样改变(图2)。

2.23组重量比较分析 C组重量与A组、B组差异显著(P<0.05)。见表1。

2.3GAG含量测定 B组与A组GAG含量差异无统计学意义(P>0.05)，C组GAG含量明显低于A组和B组(P<0.05)。见表1。

图1 原代BMSCs培养2 d后镜下观察(×40)

图2 原代软骨细胞4 d镜下观察(×40)

2.43组标本肉眼观察 A组和B组肉眼观察见标本体积较大，形态相对饱满圆润，能维持凝胶支架合成时的形状，标本内可见类似软骨组织样的胶冻状半透明物质沉积，韧性较好；C组标本凝胶支架变形，部分分解，形状不规则，韧性较差。见图3。

2.5各组HE和甲苯胺蓝染色结果 A组和B组标本中皆可见软骨细胞分布，活性良好，且可见明显的细胞外基质环绕，染色后的细胞成典型的蜂巢样结构，而C组标本染色只能见到梭形的BMSCs细胞及少量的细胞外基质。见图4。

表1 3组标本重量、GAG含量及Ⅱ型胶原蛋白mRNA比较

2.6标本Ⅱ型胶原免疫组化染色结果 A组和B组标本内皆为典型的软骨细胞染色后反应，胞核为蓝色，部分颜色较深，余细胞及胞外组织有均匀分布的棕色颗粒。而C组可见细胞核染色外，余未见明显染色物质。见图5。

2.7标本Ⅱ型胶原mRNA表达检测 A组和B组Ⅱ型胶原mRNA的表达无明显差异(P>0.05)，A组与B组均显著高于C组(P<0.05)，见表1、图6。

图3 6 w各组肉眼观察标本形态

图4 各组6 w HE染色及甲苯胺蓝染色(×400)

图5 各组6 w免疫组化染色(×400)

图6 目的基因PCR凝胶电泳

3 讨 论

关节软骨自身解剖结构特异及成熟软骨细胞再分化能力差，因而关节软骨损伤后修复是一个极其复杂且困难的过程，目前自体软骨移植技术在修复效果上较佳，但其自体软骨来源有限，另外传统的有创手术如微骨折也是一种方法，但增加创伤的同时远期修复效果也不理想〔3，4〕。组织工程技术的出现为组织的修复再生提供了一种新的可能〔5〕，组织工程中种子细胞的选择及体外培养是目前需要攻克的难点，也是目前研究的热点。BMSCs因其取材容易，来源广，有良好的多向分化潜能及优秀的增殖能力使其成为组织工程中种子细胞的热门“选手”，但存在体外定向诱导分化过程复杂，诱导生成的软骨细胞表型不稳定，软骨组织质量不佳等问题〔6，7〕。同时自体软骨细胞体外扩增后再回植修复缺损软骨已取得较好效果〔8〕，但其自体软骨来源有限，限制了其进一步的研究。基于上述问题，本实验将少量的软骨细胞与BMSCs体外共培养作为种子细胞，以希望优势互补，克服单一种子细胞来源不足、易去分化、难于精确诱导等缺点。Liu等〔9〕将BMSCs注入股骨头坏死关节软骨缺损的动物模型中在软骨缺损部位检测到有透明软骨形成，这可能是由于关节软骨组织能提供BMSCs向软骨细胞方向分化的微环境〔10〕，且骨关节炎软骨细胞较正常软骨诱导BMSCs成软骨分化能力弱〔11〕。Acharya等〔12〕研究表明BMSCs和软骨细胞体外非接触共培养后，一定比例的软骨细胞可分泌类似成软骨诱导培养基的细胞液，提供成软骨诱导微环境，诱导BMSCs向软骨细胞分化，并能形成类似新生软骨组织。且软骨细胞和干细胞隔离共培养较混合共培养有更多的蛋白聚糖的积累〔13〕。至于共培养细胞最好比例目前无一致结论〔14〕，谢鹏等〔15〕通过关节软骨细胞和BMSCs按1∶2比例共培养后发现该比例能更好地表达Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白基因，能更好维持软骨细胞表型，故本实验采用关节软骨细胞和BMSCs按1∶2比例非接触共培养进行研究。

细胞复合支架后能很好地模拟体内软骨细胞三维的空间分布，更有利于软骨细胞表型的维持，有利于软骨细胞外基质的分泌与分布〔16〕。种子细胞体外培养其支架的选择也是组织工程中不可或缺的部分，所以本研究将BMSCs先与支架复合后，让细胞分布在三维空间的支架中，再放入Transwell共培养系统与自体软骨细胞共培养，更好的模拟软骨自身修复过程。黄亮节等〔17〕研究表明纤维蛋白凝胶支架内的三维结构对于干细胞的成软骨分化的能力是优于Pellet培养体系的，可能由于纤维蛋白凝胶的三维孔隙结构更接近于正常的软骨组织，细胞因子之间交互更充分〔18〕，同时纤维蛋白可释放血小板生成因子及转化生长因子(TGF)-β〔19〕，进一步促进软骨组织的形成。Komárek等〔20〕将组织工程软骨以纤维蛋白凝胶固定于软骨下骨，修复关节软骨缺损，92.3%获得了满意效果。但一般的纤维蛋白凝胶降解时间相对较快，不能较好地匹配软骨细胞外基质的形成速度，影响最终形成的软骨组织。故本实验采用的改良纤维蛋白凝胶支架，其降解速度和新生软骨形成速度基本匹配，从而形成的新生软骨组织特性更接近正常软骨组织〔21〕。同时该支架在形成阶段为凝胶状态，可以通过关节镜微创技术体外注入需要行软骨修复的地方，为微创治疗软骨缺损提供了新的思路。

本研究结果发现，A组和B组的标本外观形态维持较好，而C组随着支架的分解不能维持较好形态，且A组和B组标本内可看见类似软骨组织样的胶冻状半透明物质沉积，组织学切片染色同样显示A组和B组标本中皆为软骨形态样细胞及软骨组织特有的陷窝样改变，其中值得注意的是B组标本中未见到梭形的BMSCs，可能是实验组细胞不仅通过共培养后成功被诱导形成软骨细胞，原有的BMSCs全部消失〔22〕，同时也分泌了细胞外基质维持了标本形态。此外细胞外蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的分泌对新生软骨组织的形成亦十分重要。陈刚等〔23〕研究表明共培养组的Ⅱ型胶原表达及糖胺聚糖含量均优于对照组。本研究结果说明BMSCs复合支架与软骨细胞共培养后能向软骨细胞分化和分泌细胞外基质，同时可能诱导生成的软骨细胞活性较分化成熟的软骨细胞高。标本Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色及RT-PCR测定Ⅱ型胶原mRNA的结果也与上述推断吻合。

综上，将BMSCs和少量的软骨细胞共培养后可以作为一种更为优秀的组织工程种子细胞，且纤维蛋白凝胶支架的可塑性，为以后可注射式微创软骨修复组织工程提供可能方法。不足之处，两种细胞共培养的最优比例、该方法的体内研究及最终软骨修复的效果还需进一步研究。