纪新博 符碧薇 顾申红 陈菊明 麦华德 林芸芸 杨智

(海南医学院 1第一附属医院老年医学科，海南 海口 570102；2基础医学与生命科学学院)

心肌梗死属心血管常见危重症之一，病情发展迅速且病死率高，心肌梗死后心肌细胞受损导致心功能不全，严重影响机体健康，减少心肌细胞损伤对于改善心功能具有重要意义〔1〕。川芎嗪作为中药川芎的有效单体成分，具有改善微循环、活血化瘀等功效，对心肌梗死大鼠具有保护作用〔2〕，川芎嗪亦可抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡过程实现对疾病的保护〔3,4〕，但在心肌梗死中其是否可影响心肌梗死区细胞增殖、凋亡情况尚不清楚。因此，本研究采用左冠状动脉前降支结扎法建立老年心肌梗死大鼠模型，探讨川芎嗪注射液对老年心肌梗死大鼠心肌细胞增殖、凋亡的影响并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性SPF级大鼠，6～10月龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2018-0012。饲养条件：21～25℃，湿度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗处理，正常饮水摄食。本实验动物在海南医学院第一附属医院暂养7 d进行实验，本研究经海南医学院第一附属医院伦理协会审核并通过。

1.2试剂与仪器 川芎嗪注射液(北京市燕京药业有限公司，批准文号：国药准字H20163160)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液(北京凯瑞基生物技术有限公司，货号：120662)；Ki67蛋白抗体(Anti-Ki67)、一抗兔抗鼠Notch、Ki67、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-1)、三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，二抗山羊抗兔IgG(美国Abcam公司，货号分别为：ab197234、ab52627、ab15580、ab179515、ab181602、ab150077)；膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，货号：C1062S)；多普勒超声诊断仪(濮阳市沪康医疗设备有限公司，型号：DW-C8)。

1.3研究方法

1.3.1模型建立及药物处理 实验前大鼠禁食过夜，26只大鼠参考文献方法〔5〕建模，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，固定于实验台上，颈正中切口，暴露出心脏后分离右颈总动脉，心导管经右侧心动脉插入左心室并连接呼吸机；而后左胸第4肋间剪段肋骨，暴露出左心耳和左心室，分离做冠状动脉前降支并结扎，检测大鼠心电图(ECG)，以ECG ST段明显抬高为模型制备成功标志，共建模成功24只。模型成功后随机分为模型组和干预组，每组12只，假手术组仅打开胸腔暴露出心脏但不结扎。

干预组每天腹腔注射120 mg/kg川芎嗪注射液〔6〕，假手术组和模型组腹腔注射等体积的生理盐水，连续6 w。

1.3.2多普勒超声检测心功能指标 实验结束后，超声诊断仪检测左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)。

1.3.3TTC染色检测心肌梗死体积 超声后迅速处死大鼠，其中4只摘除心脏，置于预冷磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，-20℃冷冻25 min，平行心室横切成6片，0.1% TTC中37℃孵育15 min，10%甲醛中室温固定1 h，拍照并用ImageJ软件分析梗死百分比。正常心肌呈红色，梗死区呈白色。

1.3.4免疫荧光检测心肌组织中细胞增殖蛋白Ki67水平 超声后迅速处死剩余大鼠，模型组取梗死区域组织，假手术组、干预组相同部位取心肌组织，部分置于4%多聚甲醛中制冰冻切片；部分组织置于-20℃冰箱当天待用；部分置于-80℃冰箱保存。冰冻切片置于4℃丙酮中固定10 min，通风后PBS漂洗，0.5%牛血清白蛋白(BSA)滴加切片中，室温封闭40 min，加一抗Ki67，4℃孵育过夜；加荧光标记的二抗，核复染，共聚焦显微镜、Image J软件分析增殖蛋白Ki67的免疫荧光图像。

1.3.5流式细胞术检测心肌组织凋亡情况 -20℃冰箱中取出心肌组织，眼科剪剪成糜状，PBS冲洗去除血细胞，胶原酶消化15 min，吸上清继续消化25 min，上清置于300目网筛，反复消化直至组织消化完全，取心肌细胞单细胞悬浮液100 μl(5×107个细胞)，加入5 μl Annexin-FITC和2.5 μl碘化丙啶(PI)溶液，避光孵育10 min后添加400 μl缓冲液，30 min内上机检测并分析。

1.3.6Western印迹检测心肌组织中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表达情况 从-80℃冰箱中取出心肌组织，RIPA裂解液冰上裂解心肌组织20 min，提取总蛋白，上样20 μg行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)转膜后封闭，一抗Notch、Ki67、Caspase-1、GAPDH，4℃孵育过夜，加入对应二抗，显色并定量分析，蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.4统计学处理 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1川芎嗪注射液对大鼠心功能影响 与假手术组相比，模型组心功能指标LVEDD、LVESD显著升高，LVEF显著降低(P<0.05)；与模型组相比，干预组心功能指标LVEDD、LVESD显著降低，LVEF显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2川芎嗪注射液对大鼠心肌梗死情况的影响 与假手术组相比，模型组心肌梗死体积显著升高(P<0.05)；与模型组相比，干预组心肌梗死体积显著降低(P<0.05)。见表2、图1。

2.3川芎嗪注射液对大鼠心肌细胞增殖的影响 与假手术组相比，模型组Ki67细胞数量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，干预组Ki67细胞数量显著升高(P<0.05)。见表2、图2。

表1 3组心功能指标比较

表2 3组心肌梗死体积、心肌细胞凋亡、Ki67细胞数量比较

2.4川芎嗪注射液对大鼠心肌细胞凋亡的影响 与假手术组相比，模型组心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组相比，干预组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见表2、图3。

2.5川芎嗪注射液对大鼠心肌组织中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白的影响 与假手术组相比，模型组心肌组织中Notch、Caspase-1蛋白水平显著升高、Ki67蛋白水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，干预组心肌组织中Notch、Caspase-1蛋白水平显著降低、Ki67蛋白水平显著升高(P<0.05)。见表3、图4。

图1 3组大鼠心肌梗死体积

蓝色-DAPI，红色-Ki67图2 3组大鼠心肌细胞增殖情况(免疫荧光染色，×200)

图3 3组大鼠心肌细胞凋亡情况

表3 3组心肌组织中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白水平比较

图4 3组大鼠心肌组织中Notch、Ki67、Caspase-1蛋白表达

3 讨 论

人口老龄化加剧会导致心肌梗死发病率升高，严重影响患者生存质量和存活寿命〔7〕。患者在血流动力学、神经体液等作用下易发生心肌重构，表现为左心室形状及结构改变，伴有心肌细胞肥大、代偿性肥厚等出现，最终发生心力衰竭〔8〕。川芎在临床上具有活血化瘀功效，川芎嗪作为川芎主要有效成分之一，可改善血流动力学、神经功能指标，从而治疗血管类疾病〔9〕。本研究结果提示左冠状动脉前降支结扎建立老年心肌梗死大鼠模型后，心肌组织出现大面积梗死，且心功能发生变化，若持续梗死则可能造成心肌缺血导致心肌细胞坏死和凋亡、抑制细胞增殖等现象；川芎嗪干预心肌梗死模型大鼠后，心肌梗死现象得到缓解，心肌状况、心功能有所改善。

细胞增殖可以诱导内皮细胞增生，形成心血管，从而影响疾病进程〔10〕。诱导胚胎干细胞衍生的心肌细胞核内皮细胞增殖，可促进血管生成，从而改善心功能、增加毛细血管密度，进而缓解受损心肌情况，缓解心肌梗死情况〔11〕。增殖蛋白Ki67作为标志性增殖蛋白，反映心肌细胞再生情况〔12，13〕；在急性心肌梗死中其水平下降，与血流动力学和心肌氧化应激损伤关系密切〔14〕。本研究结果提示可能心肌梗死情况下心肌细胞增殖降低，不能形成新的血管，使心肌组织不能发挥正常作用。川芎嗪干预心肌梗死模型大鼠后，心肌细胞增殖情况得到缓解。

正常情况下细胞凋亡可促进细胞新陈代谢，是清除衰老细胞的重要机制，也是机体免疫系统清除异常细胞的主要途径，使机体行使正常功能；其异常新陈代谢加重疾病进程〔15〕。心肌梗死患者发生心肌缺血性缺氧、缺血性坏死，易导致内质网折叠，而内质网折叠错误导致蛋白的积累及钙离子失衡，诱导细胞凋亡途径产生〔16〕。凋亡蛋白数量较多，其中Caspase家族是目前发现与凋亡家住关系最为紧密的家族，调控细胞凋亡情况〔17〕。其中Caspase-1作为Caspase家族一员，当细胞受到刺激时可促进细胞膜形成亲水通道，导致细胞膨胀裂解，是多种疾病发病的中心环节〔18〕。本研究结果提示心肌组织中内质网等细胞器发生变化，从而诱导凋亡蛋白加剧，促使凋亡途径加剧，加重疾病进程；川芎嗪干预心肌梗死模型大鼠后，心肌凋亡途径受抑制，从而缓解疾病进程。

Notch信号通路在心血管疾病中发挥重要作用，与心肌重构关系密切〔19〕。Notch受体和配体在心肌细胞中均表达，在衰竭和未衰竭心肌细胞中表达存在差异，在心肌损伤中被激活，并影响细胞增殖、分化、凋亡等情况〔20〕。本研究结果提示Notch通路在心肌梗死大鼠中被激活发挥功能；川芎嗪干预心肌梗死模型大鼠后，可能通过抑制Notch信号通路实现对心肌细胞增殖、凋亡情况的缓解，从而实现对心肌梗死的保护。

综上所述，川芎嗪注射液可保护老年心肌梗死，可能是通过抑制Notch信号通路实现对心肌细胞增殖的促进、凋亡的抑制。但Notch下游影响因子众多，对增殖、凋亡的直接作用情况尚需进一步研究。