谢青 魏丹霞 顾力华 杨仁华 刘朵 陈鹏

(1昆明市中医医院康复科，云南 昆明 650051;2昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室)

脑缺血再灌注损伤是指脑组织缺血一定时间后重新恢复血液灌注时，脑组织结构损伤及功能障碍进一步加重的现象，其主要引起脑组织细胞凋亡或坏死〔1〕。因此如何最大程度地抑制细胞凋亡，促进细胞再生，对治疗脑缺血再灌注损伤具有重要意义。中医在此方面取得了良好的疗效〔2，3〕。国家级名老中医陆家龙教授根据脑卒中(恢复期)的病因病机潜心研究出的“桑芪首乌方”，具有补益肝肾、益气活血化瘀功效，该方临床疗效显著，前期已证实了该方具有神经保护作用〔4，5〕。本文在前期研究基础上，通过观察桑芪首乌片对大脑中动脉阻塞缺血再灌注损伤模型大鼠的疗效及Notch受体1、Notch胞内结构域(NICD)和Hes家族发状分裂相关增强子(Hes)1的影响，探讨桑芪首乌片对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级SD雄性大鼠60只，体重(270±20)g，购自昆明医科大学实验动物学部，许可证号：SYXK(滇)K2015-0002。动物饲养室温度(22 ± 2)℃，相对湿度50%～65%，自由光照。

1.2药物 桑芪首乌片，由桑寄生、黄芪、制首乌、生白芍、炒杜仲、当归、川芎、丹参、天麻、钓藤、黄柏、火麻仁、夜交藤、秫米、炒谷芽、秒麦芽、三七须根17味中药组成，由昆明市中医医院制剂科提供。尼莫地平片(山东新华制药股份有限公司，20 mg/片，批号：20151121)。

1.3主要试剂与仪器 鼠抗Notch1(A-8)抗体，Santa公司；兔抗NICD(ab8387)抗体，Abcam公司；鼠抗Hes1(E-5)抗体，Santa公司；恒温振荡器，中国上海精宏实验设备有限公司；病理包埋机及切片机，德国Leica公司。1659001 蛋白电泳仪、TPC-0220G型实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪，美国Bio-Rad 公司；PCR逆转录仪，德国Biometra公司。

1.4局灶性脑缺血再灌注大鼠模型制备 SD雄性大鼠经适应性喂养1 w后开始造模，实验前动物禁食12 h，自由饮水。采用Zea-Longa改良的短暂性大鼠大脑中动脉闭塞线栓法(MCAO)并根据《药理实验方法学》(第三版)加以改进，复制局灶性脑缺血再灌注模型〔6，7〕。大鼠清醒后Bederson评分≥2分提示造模成功，纳入本实验。满分为11分，分数越高，表示动物神经行为障碍越严重。

1.5分组与给药 实验动物造模成功后，随机分为6组：正常对照组，模型对照组，桑芪首乌片低(0.7 g/kg)、中(1.4 g/kg)、高(2.8 g/kg)剂量组，尼莫地平片阳性对照组，每组10只。术后动物状态稳定后，正常对照组及模型对照组灌胃蒸馏水，桑芪首乌片低、中、高剂量组及尼莫地平片阳性对照组大鼠均分别灌胃给予相应剂量的受试药物或阳性药物。灌胃容量按1.0 ml/100 g体重计，1次/d，连续28 d。

1.6观察指标与方法

1.6.1神经行为学评分 于手术当天，术后第14天、第28天采用Bederson评分分级法分别对各组进行神经行为学评定并记录评定结果。

1.6.2梗死灶体积测定 实验结束，迅速处死大鼠，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，立即放入盛冰盐水的玻璃杯中，将玻璃杯放入4℃冰箱15 min。取出后按冠状切面顺序切厚度为2 mm的脑片5片，然后将脑片置于氯化三苯四氮唑(TTC)溶液中，避光，放入恒温振荡器，温度设置为37℃，30 min后取出脑片拍照，采用显微图像分析系统计算脑梗死体积。

1.6.3苏木素-伊红(HE)染色检测病理形态学改变 取左侧脑组织，去除嗅球后切成2 mm脑片，先用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，然后依次经过乙醇梯度脱水、石蜡包埋、HE染色，制备成永久病理封片，通过显微镜观察病理变化。

1.6.4尼氏体染色检测神经元功能状态 大鼠大脑组织石蜡切片常规脱蜡复水，蒸馏水冲洗3遍，玻片上滴加1%甲苯胺蓝完全覆盖脑组织，置于饱和水蒸气的湿盒内。将湿盒放置于37℃温箱内染色30 min。蒸馏水冲洗至流出水无明显蓝色，70%乙醇分色数秒至数分钟，以细胞质仅为浅淡蓝色终止分色。70%酒精、80%酒精、95%酒精，各2 min梯度脱水，无水乙醇2次，每次5 min，二甲苯2次，每次10 min透明，中性树胶封片随机选择10个200倍视野，计数尼氏体数量。

1.6.5实时荧光定量(RT)-PCR检测Notch1、NICD和Hes1基因表达 分离缺血再灌注损伤大鼠海马组织，用Trizol一步法提取总RNA；用M-MLV逆转录试剂盒逆转录为cDNA；以cDNA为模板，β-actin为内参检测Notch1、NICD和Hes1 3个基因的表达变化。

1.6.6Western印迹检测Notch1、NICD和Hes1蛋白表达 分离局灶性缺血再灌注损伤大鼠海马组织，提取总蛋白，以牛血清白蛋白作标准曲线，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜，封闭后分别加入Notch1、NICD和Hes1的抗体和内参β-actin的抗体，孵育；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育；洗膜后用Western印迹荧光试剂激发荧光，显示于X片，经显影、扫描后用Image Pro Plus软件进行显影条带的灰度值比较，以β-actin为内参，比较各组Notch1、NICD和Hes1 3个蛋白的相对表达量。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能缺损评分 除正常对照组外，造模成功，各组动物清醒后均出现不同程度的神经功能缺损。给药14 d进行神经行为评分，与正常对照组比较，模型对照组评分明显增加(P<0.05)；桑芪首乌片低、中、高剂量组及尼莫地平阳性药物对照组评分也增加，但尼莫地平阳性对照组及桑芪首乌片高剂量组评分均明显低于模型对照组(P<0.05)。给药28 d，模型对照组评分进一步增加；尼莫地平阳性药物对照组及桑芪首乌片中、高剂量组评分均明显低于模型对照组(P<0.05)，见表1。

表1 各组神经行为评分及脑梗死灶大小比较

2.2各组脑梗死体积比较 除正常对照组外，其余各组均出现明显的梗死灶。桑芪首乌片各剂量治疗组及尼莫地平阳性对照组梗死灶明显，但梗死范围较模型对照组明显减小，见图1。经28 d药物治疗后，桑芪首乌片中、高剂量组、尼莫地平阳性对照组梗死灶体积、修正梗死灶体积和梗死率与模型对照组比较均明显缩小(P<0.05)，见表1。

1～6：桑芪首乌片低、中、高剂量组、尼莫地平阳性对照组、模型对照组和正常对照组；图5同图1 各组脑梗死灶

2.3各组病理学改变 正常对照组细胞排列整齐，细胞核居中，核膜、核仁清晰；模型对照组细胞排列紊乱，细胞核碎裂、溶解、消失，出现大片红染区域，细胞坏死明显；尼莫地平阳性对照组及桑芪首乌片各剂量组细胞排列紊乱，但细胞坏死范围明显较模型对照组减小；且桑芪首乌片低、中、高剂量组细胞坏死数量与剂量呈负相关，见图2。

图2 各组脑梗死病理改变(HE染色，×400)

2.4各组尼氏体计数 正常对照组神经元细胞排列紧密，细胞形态完整，可见块状及颗粒状尼氏体，数量较多。模型对照组神经元细胞胞质内尼氏体溶解消失，数量减少，与正常对照组比较差异显著(P<0.05);桑芪首乌片低、中、高剂量组随剂量增加，细胞形态明显改善，尼氏体数量增加；3个剂量的桑芪首乌片组和尼莫地平阳性对照组与模型对照组比较，尼氏体数量显著增加(P<0.05)，见图3、表2。

2.5各组脑组织中Notch1、NICD和Hes1mRNA表达 模型对照组与正常对照组比较，Notch1、NICD和Hes1 3个基因表达均有增加，但差异没有统计学意义(P>0.05)。经28 d给药治疗，与模型对照组比较，桑芪首乌片中、高剂量组及尼莫地平阳性对照组3个基因表达均明显增加(P<0.05)；桑芪首乌片低剂量组与模型组比较，3个基因表达虽有增加，但差异没有统计学意义(P>0.05)，见表2、图4。

2.6各组脑组织中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达 与正常对照组比较，模型对照组Notch1、NICD和Hes1蛋白的表达水平均有增加，但差异没有统计学意义(P>0.05)。与模型对照组比较，桑芪首乌片中、高剂量组及尼莫地平阳性对照组上述3个蛋白表达均明显增加(P<0.05)；桑芪首乌片低剂量组与模型组比较，3个蛋白表达虽有增加，但差异没有统计学意义(P>0.05)，见图5、表3。

图3 各组脑组织中尼氏体数量(尼氏体染色，×200)

表2 各组脑组织中尼氏体数量和局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Notch1、NICD及Hes1 mRNA相对表达比较

图4 各组基因扩增曲线

图5 各组局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达

表3 各组Notch1、NICD及Hes1蛋白表达

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤引起神经元坏死或凋亡导致脑功能障碍，可引起不同程度的神经功能缺损症状，是引起患者致残的重要原因。目前，无论是溶栓、介入、营养神经、康复训练等均无法完全恢复患者的神经功能。因此，寻找更好的方法促进神经再生以替代受损的脑组织，改善患者的神经功能，提高患者的生活质量一直是国内外研究的热点〔8〕。

神经干细胞(NSCs)是一种具有分化潜能和自我更新能力的母细胞，在生理状态下多处于“静息”状态，在缺血或创伤性损伤刺激下，NSCs可被激活，分化成熟为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，并迁移到特定的区域，替代并修复受损的神经元，一定程度上改善神经功能缺损。大量研究证实，内源性 NSCs 的增殖、迁移和定向分化，能改善脑缺血后的神经功能缺损症状〔9〕。然而内源性NSCs的增殖数量有限，不足以进行自我代偿和修复。外源性NSCs移植又因为干细胞资源匮乏及移植后的免疫排斥反应等在临床应用中受到诸多限制。因此，最大程度地促进内源性NSCs增殖、迁移、分化，恢复和重建神经功能成为目前研究的热点〔10〕。

神经再生过程受到多种细胞信号通路和因子的调控，其中Notch信号通路是NSCs维持和自我更新的关键调节因子，与神经再生密切相关〔11～13〕。Yoon等〔14〕在研究小鼠大脑的母细胞时发现，在缺乏内源性和外源性的生长因子而仅有Notch信号通路时，就足够支持NSCc的自我更新。陈娉婷等〔15〕研究发现通过调节Notch信号通路，上调Notch1、Notch2蛋白表达水平，可促进脑缺血再灌注大鼠神经功能恢复。Notch信号通路主要有Notch受体、Notch配体、转录因子及下游靶基因组成。当相邻细胞间的Notch配体与受体结合后，引起受体多次水解释放其胞内活性结构域(NICD)入核。NICD与转录因子结合，使其从转录抑制状态变为激活状态，启动靶基因HES-1/HES-5等最终发挥生物学效应〔16〕。

Notch1是Notch受体中最重要的亚型，其在NSCs增殖中发挥着重要作用〔17〕。NICD是Notch受体的活性部分，是Notch信号活化的标志。Notch信号通路激活后主要通过Hes1转录因子促进NSCs增殖，维持其干性特征，当Hes1失活时，NSCs增殖抑制并向神经元方向分化〔18〕。Wang等〔19〕研究发现成年鼠在脑缺血缺氧后，神经干细胞的增殖过程中，NICD和HES1的表达水平增高，阻断Notch通路后，NICD、HES1的表达减少，同时神经干细胞的增殖也明显减少。房钰钞等〔20〕研究发现miR-155缺失可上调Notch1、NICD和Hes1表达，使神经元凋亡减轻。王俊杰等〔3〕研究表明地黄饮子能改善 MCAO 大鼠模型的神经功能缺损，减小脑梗死体积，减轻脑组织病理改变，可能与激活 Notch信号通路，上调 Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA 的表达，促进 NSCs 增殖有关。

脑缺血再灌注损伤属“中风”范畴，国家级名老中医陆家龙教授认为其恢复期病机多为本虚标实，以肝肾不足、气血亏虚为本，以瘀血内停、痰浊阻络为标〔21〕。“桑芪首乌方”能明显改善脑梗死患者的中医证候及偏瘫肢体的运动功能，其总有效率高达85.29%；同时基础研究也证实了该方能上调MCAO模型大鼠脑组织中脑源性神经生长因子及其受体酪氨酸激酶B的表达。本研究选取桑芪首乌片干预，方中桑寄生、首乌等补肝肾、益精血，配伍黄芪以益气活血化瘀。诸药合用，使肝有所补，肾有所滋，脑有所养，精血得旺，髓海得充，瘀去痰除，经络通畅。