梁媛 郭霞 刘吉娜 赵雷 郝然 曹静 张淑君

(1承德医学院附属医院耳鼻喉科，河北 承德 067000；2河北大学附属医院耳鼻咽喉科)

感音神经性耳聋是导致患者听觉损伤的常见类型，患者出现听力障碍，对人们的日常生活带来严重的影响。感音神经性聋是因为机体听神经、内耳、听觉中枢发生器质性病变，对声音感受、分析起到一定的阻碍作用，导致听力减退，严重的会导致听力完全丧失〔1〕。目前临床中主要通过扩血管药物进行治疗感音神经性聋，有助于内耳血流量提高，对血管痉挛也起到改善作用〔2〕，但是治疗效果不明显。Liu等〔3〕研究指出，5-磷酸二酯酶(PDE5)蛋白在耳蜗中显示高表达，提示在听觉损伤方面PDE5抑制剂具有潜在治疗价值。他达那非属于一种选择性的PDE5抑制剂，能有效提高机体血液中环磷酸鸟苷(cGMP)、一氧化氮(NO)水平，在选择性扩张肺血管方面发挥着重要作用〔4〕。目前关于他达那非治疗感音神经性聋相关研究较少。本研究探讨不同浓度他达那非对感音神经性聋豚鼠模型听力损伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1材料 选取60只健康雄性豚鼠，鼠龄2个月，体重220～300 g，均由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号：SYXK(冀)2018-008。所有豚鼠耳廓反射灵敏，均在室温22℃、湿度50%的安静环境下饲养。

1.2实验方法

1.2.1感音神经性聋豚鼠模型建立及分组 60只豚鼠中随机选取12只为正常组，其余48只参考文献〔5〕建立感音神经性聋模型：采用40 mg/kg戊巴比妥钠对48只豚鼠给予腹腔麻醉，无菌条件下在豚鼠颅顶双侧皮质听区，通过硬膜手术将不锈钢丝慢性电极植入其中，牙科水泥固定1 w，将每只豚鼠单笼饲养，在暴露仓中，白噪音为20～2 000 Hz，通过扩音器(GY型400W)放大，通过扬声器在暴露仓中播放，频率分析仪(B&K 2107型)完成连续监测，暴露声压级110 dB，1次/d，每次持续1.5 h，连续干预1 w。正常组只做不锈钢丝慢性电极植入手术。48只模型豚鼠随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各12只。豚鼠对外界声刺激无反应，耳廓无抖动，耳反射完全消失，耳廓下垂，说明模型建立成功。

1.2.2药物干预 待模型建立成功后，正常组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射，低、中、高剂量组给予他达那非(分别为0.1、1.0、2.0 mg/kg生理盐水稀释)腹腔注射，1次/d。各组豚鼠连续干预4 w。

1.2.3耳廓竖立、耳动反射检查 模型建立后，各组豚鼠均在距离其30 cm位置用力击掌，观察各组耳廓竖立、抖动等状况，击掌5次，每次间隔2 s，在安静无杂音的环境中进行，全程录像记录实验数据。评估标准：①豚鼠耳廓无抖动，耳反射完全消失为(-)；②豚鼠耳廓有微弱抖动，耳反射阈值有明显提高为(+)；③豚鼠耳廓有明显的抖动，耳反射阈值有提高为()；④豚鼠耳廓抖动灵敏，耳反射阈值无变化为()。

1.2.4听性脑干反应(ABR)阈值、Ⅰ波潜伏期检查 在豚鼠清醒状态下将其关在隔音电屏蔽室中，对豚鼠颅顶部位电极进行记录，选择豚鼠同侧及对侧乳突部位置入参考和接地电极。参考数值设置：滤波带30～3 000 Hz，1 024次叠加，扫描15 ms，方波脉冲刺激0.1 ms，频率为20 Hz，统计各组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期数据。

1.2.5氧化应激、炎症因子相关指标检测 抽取豚鼠腹部静脉血3 ml，以3 000 r/min离心速度，离心处理10 min后，分离上层血清。采用硫代巴比妥酸检测丙二醛(MDA)水平；采用黄嘌呤氧化酶反应检测超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧反应产生NO，与亲核性物质形成有色化合物，在530 nm波长下计算诱导型一氧化氮合酶(iNOS)浓度。采用酶联免疫吸附试验检测白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平：将提前稀释好的标准品100 μl加入相应的微孔板反应空中，第1孔只加样品稀释液为零孔。盖上模板混合均匀，在37℃下处理90 min，甩去孔内液体，吸干水分；将准备好的抗体加入到每孔中0.1 ml，在37℃下处理60 min，底物四甲基联苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔内液体，每孔中加满0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔内液体，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光处理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS终止液，即蓝色变为黄色。在波长450 mm处分析IL-6、TNF-α水平。

1.2.6耳蜗组织病理学观察 处死豚鼠，在枕骨大孔处解剖后快速提取耳蜗组织制作标本，将其置于4%的多聚甲醛中进行固定，制作常规石蜡切片，在浓度0.5%苏木素-伊红染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片。

1.2.7Notch2、hes1蛋白表达检测 采用Western印迹检测，将采集到的血液标本10 000 r/min离心处理10 min，对上清液进行提取后，二喹啉甲酸(BCA)进行蛋白定量检测，在2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(Notch2、hes1一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次为5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

1.3统计学处理 采用SPSS20.0软件行方差分析、t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组豚鼠耳廓竖立、耳动反射比较 正常组听觉及耳动反射表现为()，经过外界声刺激耳廓竖起。模型组经过外界声刺激，耳廓表现为无抖动，无反射，耳廓下垂，耳动反射为(-)。低剂量组经过外界声刺激耳廓抖动较弱，耳动反射为(+)，耳廓下垂；中剂量组经过外界声刺激耳廓有抖动，耳动反射为()，耳廓半竖起半下垂；高剂量组经过外界声刺激耳廓明显抖动，耳动反射为()，耳廓竖起，下垂不明显。见图1。

2.2各组豚鼠ABR阈值、Ⅰ波潜伏期比较 与正常组相比，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量组相比，高剂量组ABR阈值、Ⅰ波潜伏期降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 各组豚鼠耳廓竖立情况比较

表1 各组豚鼠ABR阈值、Ⅰ波潜伏期、氧化应激及炎症因子相关指标比较

2.3各组豚鼠氧化应激及炎症因子相关指标比较 与正常组相比，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组SOD水平降低，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量组相比，高剂量组SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.4各组豚鼠耳蜗组织病理学观察 正常组耳蜗组织未见淋巴积水，前庭膜完整、平直，鼓阶、前庭阶、蜗管结构完整。模型组耳蜗组织出现不同程度的积水，前庭阶方向隆起扩张，有前庭膜发生破裂。低剂量组、中剂量组、高剂量组积水程度均有不同程度的缓解，其中中剂量组前庭膜膨隆程度较轻，高剂量组淋巴积水消失，前庭膜正常，病理学状况得到明显改善。见图2。

图2 各组耳蜗组织病理学观察(HE染色，×200)

2.5各组Notch2、hes1蛋白表达比较 与正常组相比，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组Notch2、hes1蛋白表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组Notch2、hes1蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组Notch2、hes1蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量组相比，高剂量组Notch2、hes1蛋白表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组Notch2、hes1蛋白表达比较

图3 各组Notch2、hes1蛋白表达

3 讨 论

感音神经性聋属于一种常见的听力损伤疾病，其发病原因是因为耳蜗中的毛细胞被损害，坚持早发现、早治疗，能最大程度地恢复患者听力〔6〕。豚鼠与其他实验动物相比具有发达的神经系统，对声音的敏感性较高，一方面试因为豚鼠为大耳廓，听觉耳动反射较为明显；另一方是豚鼠的耳蜗结构与人有共同之处，通过解剖能得到完整的耳蜗〔7，8〕，因此本文研究选择豚鼠作为研究动物。

本研究结果提示，高浓度他达那非对豚鼠形态学变化起到一定的保护作用。ABR属于一种神经源性电活动，在听力测试中被广泛应用，能清晰地显示各波段的起源，常被用来诊断听觉损伤〔9〕。相关研究证实，短声会导致ABR耳蜗底回，短声引起的低频刺激会导致毛细胞产生Ⅰ波，一旦发生损伤，行波会出现延迟，与耳蜗铺片底回尤其是钩端毛细胞严重损伤有关〔10，11〕。本研究结果提示，高浓度他达那非能减轻对豚鼠耳蜗毛细胞损伤，对其听觉起到一定的保护作用。

MDA是膜脂过氧化过程中产生的主要产物，其水平大量增加会导致细胞膜发生损伤，临床中常用来反映膜脂过氧化过程损伤程度〔12〕。SOD属于一种抗氧化酶，在机体中广泛存在，其生理活性特殊，对机体中的自由基有清除作用，常用SOD含量反映机体受自由基攻击的严重程度〔13〕。活性氧(ROS)是氧气正常代谢的产物，在其信号转导过程中NO、过氧化氢等发挥着重要作用。他达那非对加内皮型NO释放有一定的促进作用，对内皮细胞功能有一定的改善作用〔14〕。本研究中他达那非干预后，豚鼠氧化应激反应被抑制，呈现浓度依赖。Shin等〔15〕研究指出，噪音诱导耳蜗损伤，IL-6在螺旋神经节、侧壁细胞中发挥着重要作用。目前已经有研究证实，IL-6能对急性耳蜗损伤有诱导作用〔16〕。TNF-α会促进促炎细胞在耳蜗组织中大量累积〔17〕。本研究证实，高剂量他达那能明显抑制感音神经性聋豚鼠模型炎症反应。

Notch蛋白主要存在于细胞膜受体中，对基因转录有直接调节作用，通过对细胞分化信号、特化基因表达进行调控，保留细胞特化的潜力〔18〕。hes1属于Notch信号通路下游中重要的效应因子，在耳蜗的发育中起到参与作用，对毛细胞的分化有调节功能〔19，20〕。Liu等〔21〕研究指出，hes1过表达会抑制毛细胞分化，从而发挥负性调节作用，Notch2/hes1信号通路在毛细胞损伤、修复过程中至关重要。本研究提示，通过调控Notch2/hes1信号通路，参与毛细胞损伤、修复过程，可修复豚鼠听力损伤。

综上，他达那非对感音神经性聋豚鼠模型干预效果显著，能改善豚鼠听力，通过调控Notch2/hes1蛋白，抑制氧化应激反应及炎症反应，对听力损伤起到一定的修复作用。