姚本海 刘海军 张霞 郑永素 徐祖才

(遵义医科大学附属医院神经内科，贵州 遵义 563003)

酒精中毒的患者越来越多。酒精中毒所致的心理健康和社会问题是当前重大的世界性公共卫生问题之一〔1〕。目前治疗慢性酒精中毒的手段有限。研究显示，丁基苯酞(NBP)抑制炎症反应，神经元细胞保护、抑制神经细胞凋亡，促进神经再生等功能〔2〕。本研究基于NBP多靶点的作用，通过慢性酒精中毒大鼠模型的建立，观察NBP对慢性酒精中毒大鼠学习、记忆能力的影响及血清和海马组织IL-12、IFN-γ和BDNF水平的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物、仪器与试剂 28只6～8周龄SD雄性大鼠(300～330 g)购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。NBP软胶囊(石药集团恩必普药业有限公司，国药准字H20050299)、无水乙醇(西陇科技股份有限公司，国产分析纯试剂，批号19012002)、Morris水迷宫系统(上海玉研科学仪器有限公司，型号：JLBehv-MWMG动物行为分析软件)。脑源性神经营养因子(BDNF)试剂盒(MM-0209R1，酶免)、白细胞介素(IL)-12/P70试剂盒(MM-0140R1，酶免)、干扰素(IFN)-γ试剂盒(MM-0198R1，酶免)。

1.2实验分组及慢性酒精中毒大鼠模型建立 将28只大鼠分为正常对照组(n=6)、模型组(n=8)、NBP高剂量组(n=6)、NBP低剂量组(n=8)。除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠适应性喂养7 d后，连续28 d给予大鼠6%(V/V)酒精水溶液饮用，酒精溶液每日9∶00配制，构建慢性酒精中毒大鼠模型〔3，4〕。28 d后按NBP低剂量(10 mg/kg)和高剂量(40 mg/kg)灌胃给药14 d，模型组正常喂养，对照组灌胃等剂量的玉米油(5 ml/kg)。

1.3行为学测试 14 d灌胃结束后，所有大鼠进行连续7 d的Morris水迷宫实验。定位航行实验：用于检测大鼠对水迷宫的学习和记忆能力。实验前一天预先将大鼠置于水迷宫中自由游泳60 s，让其适应水迷宫环境。在学习过程中，大鼠连续训练5 d。每次实验大鼠在4个不同方向中将头朝池壁放入水池，每天次序不同，任其游泳，直至找到平台，并允许大鼠在平台上停留20 s以达到强化记忆效果。通过摄像观察并记录大鼠寻找隐藏在水面下平台的路线和逃避潜伏期(从入水到爬上平台所需的时间)，如果大鼠在60 s内未到达平台，逃避潜伏期以60 s记录，并由实验者将其引至平台停留20 s。水迷宫周围的标志物固定，无声、光、人的干扰。空间探索实验：用于检测大鼠学会寻找平台后对平台的空间位置记忆的能力。前6 d训练结束后，实验第7天进行空间探索实验，撤除平台，将大鼠从原先未游过的方向放入水中，记录大鼠在目标象限及其他象限所花的时间。

1.4血清和海马组织中IL-12、IFN-γ和BDNF的测定 Morris水迷宫实验结束后，腹腔注射10%的水合氯醛(3 ml/kg)处死大鼠，腹主动脉取血，离心保留血清；并开颅取海马组织。采用双抗体夹心法测定血清和海马区中 IL-12、IFN-γ和BDNF含量，按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书进行操作。

1.5统计学分析 采用Graphpad Prism7软件，组间的显著性差异经one-way和two-way ANOVA分析。

2 结 果

2.1NBP对慢性酒精中毒大鼠的空间学习记忆障碍的影响 水迷宫定位航行实验结果表明，各组大鼠随着训练时间延长逃避潜伏期逐渐变短，模型组逃避潜伏期较对照组延长，在第3天时差异明显(P<0.01)；NBP低剂量和高剂量治疗后缩短了大鼠的逃避潜伏期，在第3天和第4天时差异明显(P<0.05)，见表1。提示NBP改善大鼠学习记忆能力是在用药的中期阶段。Morris水迷宫空间探索实验结果表明，模型组大鼠在平台象限停留时间〔(17.72±5.37)s〕较正常对照组〔(15.89±5.23)s〕增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；NBP低剂量组〔(11.62±6.30)s〕和高剂量组〔(11.01±7.24)s〕治疗后减少了平台象限停留时间，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组潜伏期比较

2.2NBP对慢性酒精中毒大鼠血清和海马组织中细胞因子的影响 与正常对照组相比，模型组血清和海马组织中IL-12和IFN-γ水平显著上调(P<0.01)，BDNF水平显著下调(P<0.01)。与模型组比较，NBP低剂量组血清IL-12水平无统计学差异(P>0.05)；NBP高剂量组血清IL-12水平显著降低(P<0.01)；NBP低剂量组和高剂量组血清和海马IFN-γ及BDNF水平差异显著(P<0.01，P<0.05)，见表2。说明NBP对慢性酒精中毒大鼠具有保护作用。

表2 各组血清及海马组织IL-12、IFN-γ和BDNF含量比较

3 讨 论

大量饮酒是全球发病率和死亡率的最大因素之一〔5〕。研究表明，长期过量饮酒与执行功能、记忆和元认知能力的认知缺陷(从轻度到重度)有关，并伴有情感过程和社交认知的损害〔6〕。本研究表明，NBP在一定程度上可能改善慢性酒精中毒大鼠学习、记忆力能力。已有研究表明，NBP 能够减轻慢性酒精中毒大鼠的症状，改善大鼠学习记忆能力〔7〕。研究发现，乙醇能使神经胶质细胞释放多种炎性因子如IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6等，通过促进炎性介质如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶(COX)-2等合成，这些炎症物质对大脑产生严重的神经毒性作用，从而导致脑功能损害〔8，9〕。本研究结果表明，NBP对慢性酒精中毒大鼠炎症因子有抑制作用，促进神经修复，对神经功能有保护作用。研究表明，NBP可减轻氧化应激，减弱炎症反应，抑制神经元凋亡，并改善突触可塑性和认知功能〔10～12〕。Climent 等〔13〕证实酒精可降低BDNF的表达，从而影响神经元的生长、分化及生存。研究认为，NBP可能通过血管内皮细胞促进BDNF的分泌，保护神经细胞〔14～16〕。NBP可上调大鼠梗死区周围和海马区缺血脑组织中BDNF和NGF的表达，并可能通过此机制起到保护作用〔17〕。NBP治疗急性脑梗死患者，可下调炎性因子的表达发挥抗炎效应，提高BDNF、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达，修复神经功能，发挥神经保护作用〔18〕。本研究Morris水迷宫空间探索实验结果表明差异无统计学意义，可能是大鼠样本量较少，在后期的相关实验中应加大样本量进一步验证。