李航 于佳龙 罗勇 蒋其俊 杨开华

(遵义市第一人民医院(遵义医科大学第三附属医院)神经外科，贵州 遵义 563000)

脑胶质瘤是常见的颅内恶性肿瘤之一，占原发性脑部肿瘤的60%以上〔1〕。脑胶质瘤患者的病死率和残疾率极高。根据恶性程度，世界卫生组织(WHO)通常将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ 4个级别。Ⅰ和Ⅱ型通常被划分为低级别胶质瘤，Ⅲ和Ⅳ型则被划分为高级别胶质瘤〔2〕。长期以来，针对脑胶质瘤发病机制的研究有限，相应的治疗手段有限，疗效有限，如临床常用替莫唑胺等药物治疗等，因此，寻找新临床诊疗措施的意义重大。近年来，随基础医学研究的迅速发展，科学家们发现了许多胶质瘤的分子标记，特别是异柠檬酸脱氢酶同工酶(IDH)突变与原发性胶质瘤的发生发展密切相关〔3，4〕。

有报道在2008年指出，在胶质母细胞瘤外显子序列中发现胶质瘤与IDH1突变有关，并且IDH1基因132位的精氨酸(R)被发现转化为组氨酸(H)〔5〕。后续研究表明，IDH1 R132H突变是胶质瘤中最常见的突变〔6〕，且80%～90%的Ⅰ和Ⅱ型胶质瘤存在IDH突变〔7〕。多项研究表明，继发性胶质母细胞瘤中多见IDH1 突变，且其阳性率出现发病年龄降低的趋势，同时，IDH1 突变在弥漫性星形细胞瘤与少枝胶质细胞瘤也被发现，且专属性较强〔8～10〕。本研究采用IMab-1作为IDH1 R132H 的特异性抗体，联合免疫组化及Western印迹检测方法，测定人脑胶质瘤中IDH1 基因突变发生情况，探讨检测方法的可靠性及在脑胶质瘤检测中的临床意义。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2012年1月至2019年1月遵义市第一人民医院、遵义医学院附属医院及贵州航天医院的脑胶质瘤标本107例。其中，男60例，女47例，年龄37～85岁，平均(60.5±4.2)岁。病理分型依据2007年WHO神经系统肿瘤新分类标准，包括Ⅰ级8例、Ⅱ级48例、Ⅲ级28例、Ⅳ级23例。另取其他中枢神经系统(CNS)肿瘤标本18例，包括脑膜瘤8例，垂体瘤6例，中枢神经系统淋巴瘤4例。取脑外科手术治疗的内减压正常脑组织20例为对照。

1.2试剂与仪器 鼠抗人IDH1抗体购自德国Dianova公司；羊抗鼠二抗购自美国Abcam公司；蛋白提取试剂盒购自美国Invent Biotechnologies公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、电化学发光(ECL)液、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司提供；人IDH 基因组序列来自GenBank，引物由上海美吉生物技术有限公司提供；RNA提取试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒由美国ABI公司提供；PCR仪由美国Bio-Rad公司生产；Triolz和荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；美国ABI3730测序仪进行基因片段测序；96孔纯化板购自美国Millipore公司。

1.3免疫组化 SP法进行免疫组化：切片常规脱蜡，3%过氧化氢(80%甲醇)阻断过氧化物酶，正常山羊血清封闭，行微波炉抗原修复后，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2～3次，甩去多余液体；滴加Ⅰ抗(鼠抗人IDH1抗体，DIANOVA，Clone H09)，4℃过夜，37℃复温45 min。PBS洗3次各5 min；滴加Ⅱ抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗)，37℃，1 h，链酶亲和素-过氧化物酶溶液10 min，PBS或自来水冲洗10 min；二氨基联苯胺(DAB)显色2 min，中性树胶封片，晾干，显微镜下观察。

1.4Western印迹 将适量的胶质瘤(约400 mg)置于-80℃冰箱中保存，放入标记管中，用4℃PBS洗涤5 min(4次)。清洗后，用剪刀剪开肺组织，加入裂解液，再加入苯甲基磺酰氟(PMSF)到裂解液中。裂解液与PMSF的比例为100∶1，用搅拌棒充分研磨10 min，将裂解后的样品置于高速冷冻台式离心机中，以13 000 r/min离心5 min，除去上清液，丢弃剩余颗粒，样品保存在-80℃冰箱中进行蛋白质含量测定。冰上匀浆，使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取组织总蛋白，使用细胞质和核提取试剂盒(USA)提取细胞核和细胞质蛋白质，Bradford 法测定蛋白浓度。每孔加入50 μg蛋白，10%～12% SDS-PAGE分离，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗鼠抗人IDH1抗体，4℃过夜，次日室温孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗2 h。电化学发光法检测，曝光、显影，采用凝胶成像分析系统拍照，Image J软件对相应条带进行灰度分析。

1.5结果判断 (1)免疫组化染色阳性判定标准：细胞胞质中有棕黄色或棕色颗粒；阅读过程由2位经验丰富的病理学家同时进行盲法评估，以双半定量法进行评分。操作详细步骤：显微镜下随机定位高倍视野观察点8个，同时手工记录镜下的高倍视野中显示4个阳性染色结果的百分率。突变阳性率10%以上的IDH1突变为阳性判断标准。(2) Western印迹阳性检测：经PVDF膜显示结果，若52 kD附近显示阳性条带，则可将结果判断为IDH1突变阳性。

1.6基因片段测序 基因组经提取DNA后，进行PCR扩增与纯化：引物设计软件Primer5.0设计目标引物。参考模板为人IDH基因组序列(GenBank登录号：NM 005896)，引物由上海美吉生物技术有限公司合成。引物序列：IDH正义链：5′-CAAGCCGAGAATGCTGAGTTCAT-G-3′，反义链：5′-GCAA-GGGATGATTTCCTGCCAG-3′。PCR扩增反应体系包括10×ExTaq缓冲液(3 μl)，IDH-正义链(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，IDH-反义链(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，纯净水(18.8 μl)，DNA(1 μl)，脱氧核糖核苷酸(dNTP)溶液(2.5 mmol/L,0.5 μl)，Ex Taq溶液(0.2 μl)，混合齐全后，进行PCR扩增反应，反应完成后，按照Millipore 公司96纯化板操作流程操作，经转板操作后，使用ABI3730型测序分析仪进行测序。

1.7统计学方法 采用Graphpad Prism6软件进行χ2或Fisher精确概率检验。

2 结 果

2.1不同病理类型肿瘤染色 不同病理类型肿瘤(IDH1基因突变)的胞质呈棕褐色或棕黄色，强度不同。见图1。

A.IDH1 突变阴性弥漫性星形细胞瘤;B.IDH1突变阳性继发性胶质母细胞瘤;C.IDH1突变阳性原发性胶质母细胞瘤;D.IDH1突变阳性弥漫性星形细胞瘤图1 不同病理类型肿瘤(免疫组化染色，×400)

2.2Western印迹 IDH1 R132H突变阳性蛋白在52 kD附近显示明显的电泳条带，而野生型(WT)IDH1 R132H蛋白未见阳性条带，见图2。

1～4：弥漫性星形细胞瘤,间变性星形细胞瘤,少枝胶质细胞瘤，间变性少枝胶质瘤；132H：IDH1 R132H 突变型图2 Western印迹检测结果

2.3基因测序结果 WT IDH1 基因在R132 位点显示CGT正常单峰形态；IDH1 R132H基因突变主要为杂合性点突变，该基因132 位点因为核苷酸突变(CGT→CAT)，蛋白表达由组氨酸取代原编排的精氨酸位点，而CAT 序列中的A 位置显示典型的双峰形态。

2.4IDH1突变3种检测方法比较 IDH1 基因阳性检测结果：基因片段测序方法(A组)为54例，免疫组化法(B组)为45例，Western印迹(C组)为49 例，3组结果无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 3种检测方法IDH1突变比较(n)

3 讨 论

IDH催化异柠檬酸产生α-酮戊二酸(KG)。当IDH1基因突变时，其相应的功能和产物会发生变化。它通过产生高水平的2-羟基戊二酸(Hg)，使机体的血管内皮生长因子(VEGF)水平上调，加速形成肿瘤微环境，另外，体内的低氧诱导因子(HIF)-1α水平也因此增长迅速，加速胶质瘤对正常组织的侵袭，从而抑制胶质瘤干细胞的分化。导致胶质瘤的发生和发展〔11～13〕。研究表明，星形细胞瘤或胶质母细胞瘤中的IDH1基因突变较为频繁，室管膜瘤、髓母细胞瘤等其他胶质瘤中IDH1基因突变较为少见〔14〕。本文选取的不同病理类型的脑胶质瘤中，毛细胞星形细胞瘤室管膜瘤、间变室管膜瘤、髓母细胞瘤均未检出IDH1基因突变。其中，IDH1基因突变位点基本位于异柠檬酸盐的结合部位的进化保守区域132 位点，突变类型大多部分为杂合型〔15〕。

基因突变的检测方法较多，包括基因测序、免疫组织化学及Western印迹等。基因测序在现阶段的应用较广，该检测方法也是 IDH1 基因突变的最常用手段〔16〕。特别是临床诊疗方面，由于精准医学概念的提出，个体化治疗显得尤为重要。基因测序作为临检常用手段，伴随肿瘤治疗的全生命周期。临床对肿瘤的检测结果的可信度基本来源于对肿瘤DNA的序列分析。近年来，随人工智能及生物医学的快速发展，临床快速测序技术已经达到一个新的高度，患者接受该技术检测的费用及时间均显著减少〔17〕。唯一的不足为该技术检测的准确性基于样本的高度纯净性，若肿瘤周围正常脑组织的DNA 受到污染或淋巴细胞浸润较多，其中的小神经胶质细胞瘤和内皮细胞即可稀释IDH1基因突变相关DNA信息，造成DNA信号低于检测限，产生假阴性结果，相反，目标信号的降低，相对抬高了背景信号的水平，也可能使原本阴性的结果转变为假阳性。研究表明，准确可信的测序检测结果主要基于至少需要20%以上突变的等位基因〔18〕。随分子生物学的快速发展，测序所需的特异性抗体也日新月异，稳定性IDH1 R132H 特异性抗体IMab-1的出现使IDH1基因突变的检测在常规病理实验室也能实现〔19〕。

另外，作为特异性的IDH1 R132H 抗体，IMab-1不与WT IDH1 基因及其他类型基因反应。经ELISA后，如果细胞胞质被染色呈棕褐色或棕黄色则表明IMab-1 染色阳性。常规情况下，IDH1 基因突变特异性表达于肿瘤细胞，因此其他体细胞经ELISA后不会被染色。

有报道显示，IDH1基因突变表达在毛细胞星形细胞瘤中未见，而在弥漫性星形细胞瘤中的表达明显增强，两者的组织病理诊断较为混淆，利用IMab-1可有效鉴别两者病理类型〔13〕；同时，临床发现胶质瘤患者若见IDH1突变阳性，则其预后优于IDH1突变阴性患者，因此，如果早期选择了特异性抗体IMab-1进行IDH1基因突变检测，可有效评估相关疾病的预后〔20〕。另外，本研究发现IMab-1染色强度与肿瘤病理分级无关，其原因可能为IDH1基因突变主要见于肿瘤发生的早期阶段，且不会随肿瘤的进展而出现明显增强现象；其次可能由于样本的不纯净性，本研究选取的胶质瘤样本中夹杂其他细胞，包括坏死组织、血液细胞、血管内皮细胞等，IDH1基因突变在这些组织中的表达均为阴性，最后可能与本研究的检测手段相关，试验中常用的检测手段的检测结果均存在假阴性率可能性，其差异性来源主要包括样品前处理过程与基因测序无法做到完全一致所致〔21〕。因此，采用多种方法检测，可有效降低检测的假阳性率及假阴性率。另外，本研究提示，只要样本采集及制作过程有效避免相关因素干扰，3种检测均可达到较为理想的检测结果。

综上，基于免疫组化及Western印迹技术，选用IDH1 R132H基因突变的特异性抗体IMab-1，可有效检出早期脑胶质瘤的进展状况，可为胶质瘤IDH1基因突变的筛选及相关疾病的预后评估提供理论依据。