栾海艳 周建基 张宝媛 刘明远 刘杰 李楠

(佳木斯大学 1基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室)

中国是患有糖尿病人数最多的国家之一，占全球24%，2017年糖尿病的发生率已达到11.2%，并呈现逐年上升趋势〔1〕。糖尿病也是目前已知并发症种类最多的一种疾病，其中最常发生的慢性并发症是糖尿病肾病(DN)，据统计糖尿病患者中20%～40%会并发DN，且往往会发展成为终末期肾病(ESRD)，患者5年生存率<20%。到2030年，DN将成为世界第七大致死疾病。患者不仅需要肾脏替代治疗，还需治疗比其他尿毒症患者更多更严重的合并疾病，不但耗费了大量卫生医疗资源，也给患者本人及其家属造成了沉重的心理压力和经济负担。本文旨在探讨人工合成的多肽cSN50.1对糖尿病大鼠肾损伤的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验对象及分组 清洁级雄性纯系SD大鼠，体重180～220 g，购于黑龙江省佳木斯大学实验动物中心，所有实验大鼠适应性喂养1 w后分为两组：正常对照组给予常规基础饲料饮食，模型建造组给予含高脂高糖的特殊饲料饮食；喂养4 w后，模型建造组一次性腹腔注射2%链脲佐菌素(STZ，35 mg/kg，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)，正常对照组同时注射与模型建造组等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；并在72 h后测定两组空腹血糖(FBG)水平；将符合血糖标准的大鼠(≥16.7 mmol/L)再分为模型对照组、cSN50.1低剂量组和cSN50.1高剂量组，均继续给予含高脂高糖的特殊饲料喂养直至整个实验完成。而正常对照组仍继续给予常规的基础饲料喂养。

1.2给药方案 从第9周起cSN50.1低剂量组、cSN50.1高剂量组分别给予15、30 mg/kg cSN50.1腹腔注射，2次/d；同时正常对照组和模型对照组注射等体积的生理盐水，药物干预持续4 w后进行指标检测。

1.3留取标本及检测指标 实验完成后，计量各组24 h尿液，并采用全自动生化仪检测尿蛋白(UPr)和尿肌酐(UCr)等肾功能生化指标，并计算UPr与UCr的比值。乙醚麻醉后，各组大鼠内眦静脉取血，采用全自动生化仪检测尿素氮(BUN)和FBG；大鼠处死后，称量各组大鼠肾湿重和体重，计算肾指数(肾湿重/体重)；再分别取出两肾，左肾于-80℃冰箱保存，采用RT-PCR技术检测肾组织中纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ 型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅳ和内参照β-actin的基因表达情况，各目的基因表达的相对含量采用目的基因与β-actin灰度值的比值表示，右肾用甲醛溶液浸泡固定后，石蜡包埋切片，采用苏木素-伊红(HE)染色技术检测肾组织病理变化情况。

1.4试剂 多肽cSN50.1的合成由吉尔生化(上海)有限公司完成；STZ购于Sigma公司；FBG、BUN、UPr、UCr测试试剂盒购于南京建成生物工程研究所；FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计兼合成。引物序列：FN正义：5′-CCCATCGACCAGTGCCAAGATTC-3′，反义：5′-TTCCTTCCAGCGACCCGTAGAG-3′；Collagen Ⅰ正义：5′-TTCT CCTGGCAAAGATGGACTCAAC-3′，反义：5′-GGGCTGCGGATGTTCTCAATCT-G-3′；Collagen Ⅳ正义：5′-ACTTCGCCTCCAGGAA CGACTAC-3′，反义：5′-GGGCACTTCTAAACT-CTTCCAGACAG-3′；β-actin正义：5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反义：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCA AA-3′。

1.5统计学分析 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组FBG水平和肾功能指标比较 与正常对照组相比，模型对照组FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr显著升高(P<0.01)；cSN50.1低剂量组、cSN50.1高剂量组较模型对照组均显著降低(P<0.01，P<0.05)；与正常对照组相比，cSN50.1低剂量组各指标水平仍有显著差异(P<0.01)，cSN50.1高剂量组FBG、BUN、UPr和UCr有显著差异(P<0.01，P<0.05)，但UPr/UCr无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组FBG和肾功能水平比较

2.2各组肾指数比较 与正常对照组肾指数〔(5.45±0.47)×10-3〕相比，模型对照组〔(11.29±0.92)×10-3〕显著升高(P<0.01)；cSN50.1低剂量组〔(9.47±1.66)×10-3〕较模型对照组明显下降(P<0.05)，cSN50.1高剂量组〔(7.39±0.62)×10-3〕显著下降(P<0.01)，但与正常对照组相比，cSN50.1低剂量组和高剂量组未恢复到正常水平，仍有显著差异(均P<0.01)。

2.3各组肾组织病理变化情况 HE染色结果显示，正常对照组大鼠肾组织形态正常，结构清晰；而模型对照组肾组织中肾小球体积有所增大，局部肾小管出现肿胀坏死，并伴有空泡样变性现象，系膜基质也出现增多现象，此外还有炎性浸润等病理损伤；与模型对照组比较，cSN50.1低剂量组和cSN50.1高剂量组大鼠肾组织病理损伤减轻，见图1。

图1 各组肾组织病理变化情况(HE染色，200 μm)

2.4各组肾组织中FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ基因表达比较 与正常对照组相比，模型对照组肾组织FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表达均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；cSN50.1低剂量组和cSN50.1高剂量组较模型对照组均显著降低(P<0.01)，但与正常对照组相比，仍未恢复到正常水平，有明显差异(P<0.01，P<0.05)，见表2，图2。

表2 各组FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表达

1～4：正常对照组、模型对照组、cSN50.1低剂量组、cSN50.1高剂量组图2 各组FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表达

3 讨 论

DN是一种发病机制纷繁复杂的慢性疾病，目前公认与之发病相关的因素主要包括：基因遗传、糖脂代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激刺激、炎症反应等〔2〕。其中，炎症在DN中的作用已越来越得到大家关注，几乎参与了DN发生发展的全过程〔3～5〕，因此，DN也可以被认为是一种由糖脂代谢紊乱引发的炎症性疾病〔6〕。研究发现，高血糖、高脂血症和高胰岛素血症等代谢性因素均可通过多种信号转导途径激活糖尿病患者肾组织内的固有细胞(如血管内皮细胞、足细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞)，引起这些细胞中的趋化因子、黏附因子、细胞因子等的表达增高，从而募集其他炎症细胞(如巨噬细胞和淋巴细胞等)，而这些被募集到的炎性细胞又能释放出更多的炎症细胞因子去刺激肾小管上皮细胞，使肾小管上皮细胞继续释放出更多的炎症介质、趋化因子及细胞因子，形成恶性循环，使炎症反应进一步加剧，出现UPr，甚至使肾组织出现病理性改变，肾小球基膜增厚、硬化，肾小管间质纤维化，最终逐渐进展成终末期肾脏病〔7～9〕。

cSN50.1是一种人工合成的多肽，已被证实在由多病因引起的炎症性疾病中具有较好的作用。研究发现，cSN50.1可以通过与核转运蛋白(importin)α和importin β结合，竞争性抑制应激反应转录因子(SRTFs)的入核转运，减少败血症小鼠血液、脾和肺的细菌负荷，降低血浆中促炎细胞因子和趋化因子的表达，将cSN50.1与抗生素相结合还能明显延长小鼠的平均生存时间〔10〕。此外，cSN50.1还可以通过抑制核转录因子的入核转运，减轻低密度脂蛋白(LDL)受体缺乏小鼠的代谢炎症，调控其胆固醇、三酰甘油和脂肪酸的合成，局部纠正脂质代谢紊乱、高血糖症、高胆固醇血症、高脂血症、脂肪沉滞性动脉硬化症和脂肪肝〔11〕。本研究结果提示腹腔注射cSN50.1能够明显降低2型糖尿病模型大鼠FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr水平，改善其血糖和肾功能异常情况；且cSN50.1还能使模型大鼠的肾指数下降，改善其肾脏肥大的情况；此外，cSN50.1还可以减轻模型大鼠肾组织的肾小球体积增大，系膜基质增多，肾小管肿胀坏死，炎性浸润等病理损伤情况。

DN肾组织损伤的主要病理特征是肾小球基底膜增厚、细胞外基质形成增多、细胞的足突消失，最终导致肾小球滤过率(GFR)降低，UPr增加，肾小球和肾小管发生间质纤维化〔12,13〕，而肾间质纤维化也是其他慢性肾脏疾病发展至终末期肾病的共同路径〔14,15〕。研究发现，形成肾间质纤维化的重要因素是细胞外基质的合成降解失衡，肾小球和肾间质内大量积聚并沉积的细胞外基质可引起肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发生〔16,17〕。FN、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ是细胞外基质的主要成分〔18,19〕，随着间质中细胞外基质的积累和小管基底膜破坏，FN、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ均出现过度表达现象，因此是评判肾纤维化程度的重要指标〔20〕。本研究结果表明cSN50.1能够降低糖尿病模型大鼠肾组织中致纤维化因子的表达水平，从而减轻大鼠肾组织的病理损伤程度。

综上，cSN50.1对糖尿病大鼠的肾损伤具有一定保护作用，这可能与cSN50.1可降低大鼠肾组织中纤维化因子FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA的表达有关。