张丽 李飞

(漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462000)

帕金森病(PD)临床表现主要有静止性震颤、肌紧张增强、运动迟缓、步态和姿势障碍等运动症状，并常常伴有情绪低落、焦虑、认知障碍等非运动症状〔1〕。目前，针对PD主要以补充多巴胺的药物治疗为主，但长期服用副作用日益加剧。PD发病病因尚未明确，但已有大量研究表明PD发病机制可能与脑内出现的炎症反应相关〔2，3〕。

百香果籽油是西番莲属植物——百香果加工过程中产生的副产品，具有丰富的药用和保健功效，可降压降脂、抗焦虑、抗氧化〔4〕，但百香果籽油对PD是否有作用，目前鲜少报道。本课题组采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)建立PD小鼠模型，观察百香果籽油对PD行为能力的影响，初步探讨其作用机制，为开发百香果籽油的药用价值和寻找治疗PD的神经保护药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1实验动物 C57BL/6小鼠，雄性，SPF级，体重(20±2)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。

1.2分组 小鼠在标准环境中适应性饲养1 w后，随机分为对照组、PD模型组、百香果籽油组，每组12只。

1.3仪器和试剂 石蜡切片机购于德国徕卡公司；Fluo View FV1200 激光共聚焦显微镜购于日本奥林巴斯公司；MPTP购自Sigma公司；兔抗鼠黑质酪氨酸羟化酸(TH)、Toll样受体(TLR)4和核转录因子(NF)-κB p65多克隆抗体均购于Abcam公司；羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记二抗和Cy3标记二抗以及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均购于碧云天生物技术公司。

1.4百香果籽油的制备 从百香果中取百香果籽后去杂、洗净、干燥粉碎，研磨，再加入8倍体积蒸馏水，充分搅拌至呈乳液状，1 500 r/min离心，取上清。上清中加适量饱和氯化钠(NaCl)溶液，缓慢搅拌，静置，待油水分层后收集上层油层，即获得百香果籽油〔5〕。

1.5PD小鼠模型制备及动物给药 PD模型组和百香果籽油组采用腹腔注射MPTP(30 mg/kg，连续7 d)，以建立PD小鼠模型，对照组于相同时间点腹腔注射等体积的生理盐水。自建模第8天起，百香果籽油组灌胃百香果籽油100 mg/kg，1次/d，连续6 w。PD模型组和对照组在相同时间点灌胃等体积蒸馏水。

1.6转棒实验和悬挂实验检测小鼠的平衡和抓握能力 末次给药24 h后，对各组小鼠进行行为学实验观察其平衡和抓握能力。

1.6.1转棒实验 将小鼠置于转棒仪的转杆上，开始爬行后记录小鼠在转杆上的滞留时间。每只小鼠测定2次，2次测定时间间隔至少1 h。

1.6.2悬挂实验 首先将小鼠放在小鼠笼的盖子上，轻摇笼盖，使小鼠抓握笼盖，然后将笼盖倒置，记录小鼠从笼盖倒置到坠落的时间。每只小鼠测定2次，2次测定时间间隔至少1 h。

1.7取材及指标检测

1.7.1免疫组化观察黑质TH细胞数量变化 每组各取6只小鼠进行心脏灌流、石蜡包埋，常规脱蜡脱水，抗原修复，避光孵育10 min，加入一抗(TH，1∶500)，4 ℃孵育过夜，加入二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，镜检。每张切片随机选取5个黑质视野，计数TH阳性细胞数量。

1.7.2免疫荧光染色观察黑质TLR4和NF-κB p65蛋白的表达 每组各取6只小鼠进行心脏灌流，冰冻切片，经过破膜、封闭后，加一抗(TLR4，1∶500；NF-κB p65，1∶500)过夜，二抗室温孵育2 h，DAPI孵育5 min，封片，镜检。每张切片随机选取5个黑质视野，利用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测定积分光密度值(IOD)。

1.8统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差检验、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组行为能力比较 与对照组比较，PD模型组滞留和悬挂时间均明显缩短(均P<0.05)；与PD模型组比较，百香果籽油组滞留和悬挂时间均明显延长(均P<0.05)。见表1。

表1 各组行为学比较

2.2各组小鼠黑质TH阳性细胞数量比较 与对照组〔(74.28±5.25)/mm2〕比较，PD模型组黑质TH阳性细胞数量〔(32.18±2.41)/mm2〕明显减少；与PD模型组比较，百香果籽油组黑质TH阳性细胞数量〔(46.84±2.76)/mm2〕明显增加(均P<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠黑质TH阳性细胞表达(免疫组化，×200)

2.3各组黑质TLR4和NF-κB p65蛋白的表达比较 免疫荧光染色显示，被标记上绿色荧光的为TLR4蛋白，主要表达在神经元膜上；被标记为红色荧光的为NF-κB p65蛋白，主要表达在神经元胞质中。与对照组比较，PD模型组黑质TLR4和NF-κB p65蛋白表达明显增多(P<0.05)；与PD模型组比较，百香果籽油组黑质TLR4和NF-κB p65蛋白表达明显减少(P<0.05)。见图2、图3和表2。

图2 各组小鼠黑质TLR4的表达(免疫荧光，×200)

图3 各组小鼠黑质NF-κB p65的表达(免疫荧光，×200)

表2 各组黑质TLR4和NF-κB p65蛋白表达比较值)

3 讨 论

PD的临床表现主要有静止性震颤、肌紧张增强、运动迟缓、步态和姿势障碍等运动症状。转棒实验用于检测小鼠协调运动能力的经典行为学实验，悬挂实验检测小鼠的抓握能力，本研究结果表明，注射MPTP诱导的PD小鼠模型能很好地模拟PD患者的运动症状，说明模型制备成功。

PD主要的病理特征是黑质多巴胺能神经元变性，当黑质多巴胺能神经元受损后，会导致黑质胆碱能神经元功能亢进，进而出现运动减少、动作迟缓等PD症状〔6〕。TH是儿茶酚胺合成的限速酶，多巴胺是大脑中含量最丰富的儿茶酚胺类神经递质，因此TH的表达可以作为检测PD的一项重要指标〔7〕。

PD的发病原因虽然尚未明确，但已有研究表明PD和炎症反应关系密切〔2〕。 TLR4 /NF-κB信号通路在诱导免疫/炎症反应及多种神经系统疾病过程中均发挥关键作用。TLR属于跨膜信号转导受体，其中TLR4是介导炎症反应的主要成员〔8〕。NF-κB是TLR4活化后信号传导途径中的关键分子，是连接上下游信号的通道，p65是其最具代表性的活性亚基〔9〕。研究表明，当机体受到刺激后，细胞膜上的TLR4识别相应配体，经一系列信号转导最终活化NF-κB，诱导释放大量的炎性因子，介导炎症反应〔10〕。

综上，百香果籽油可以改善MPTP诱导的PD模型小鼠的运动障碍，其机制可能与抑制炎症反应、调节氧化应激失衡，保护黑质TH神经元有关。具体机制还需要进一步研究明确。