高岩 成思源 黄晶 孙路全

(天津市北辰医院口腔科,天津 300400)

牙周炎是一种由局部因素引起的牙周支持组织慢性炎症，是我国成年人最常见的口腔问题，也是导致成年人牙齿丧失的首位因素〔1，2〕。研究表明牙周病不仅引起口腔局部感染炎症，而且作为细菌储库可引起轻微的慢性炎症反应进而影响全身各脏器功能〔3，4〕。研究已经证实在牙周炎的发生发展过程中，牙周炎致病菌(如牙龈卟啉单胞菌)是通过激活炎症细胞模式识别受体(PRRs)，包括Toll样受体(TLRs)和NOD样受体家族(NLRs)等，激活牙周炎症信号通路〔5～8〕。研究已经证实牙周炎患者免疫细胞内白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达可因细菌的改变而表达上调，而NLRP3在其中起了关键性作用。Huang等〔9〕研究发现NLRP3信号通路在慢性牙周炎炎症早期激活过程中的重要作用。通过NLRP3信号通路，牙龈上皮细胞分泌炎症细胞因子，如IL-1β，最终导致牙周组织破坏。NLRP3作为一种重要的代谢紊乱传感器，控制了肥胖相关的胰岛素抵抗及胰岛β细胞的功能障碍。肥胖是我国公共卫生领域一项日益严重的问题，由此引发的高血压、糖尿病发生率也逐渐升高。Virto等〔10〕发现肥胖会导致胰岛素敏感性降低，而流行病学调查发现，肥胖与牙周炎通过胰岛素抵抗相互关联加重肥胖及原发病。但目前，关于牙周炎、肥胖、胰岛素抵抗3者之间的作用机制尚不明确。因此，本研究通过建立SD雄性大鼠牙周炎模型，旨在探讨牙周炎加重肥胖大鼠胰岛素抵抗的相关机制及可能的信号通路。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 40只SD雄性大鼠购于第三军医大学第三附属医院野战外科研究所，动物合格证号：0001517，实验动物使用许可证号：SYXK(渝)2017-0005。普通饲料及高脂饲料均购于浙江大学实验动物中心。Trizol试剂、RT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于美国Abcam公司。饮用高温高压灭菌水，温度：24～26℃；湿度：40%～70%；白昼10 h、黑夜14 h间断照明。

1.2模型构建及分组 将40只SD大鼠随机分为4组，根据处理方式的不同分为对照组、肥胖组、模型组、治疗组。对照组：不做任何处理，浦头饲料正常饲养。肥胖组：采用高脂饮食喂养20 w。模型组：肥胖模型构建同肥胖组，成功后通过腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，取仰卧位固定，分离上颌左侧第一磨牙颊腭侧牙龈，采用正畸结扎线结扎，龈沟底局部滴入牙周病炎患者的唾液10 μl/次，诱导牙周炎模型。治疗组：参照模型组方法造模后，对大鼠进行牙周基础治疗，治疗方法包括牙龈清洁、牙龈下刮治、1%过氧化氢(H2O2)+生理盐水冲洗。

1.3Micro-CT检测 处死大鼠后，取颌骨组织固定48 h。利用Micro-CT技术，在不破坏大鼠颌骨的前提下，重建内部显微结构，测量第二磨牙釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶(AC)的距离(CEJ-AC)，计算骨丢失量及骨剩余量。

1.4苏木素-伊红(HE)染色 实验结束后处死大鼠，取下实验侧牙槽骨，放于脱钙液中24 h过夜，冲洗约2 h，常规石蜡包埋，牙体长轴近远中方向切片，烤片，冷却后低温冻存。经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。苏木素染色30～60 s，冲洗5 min，伊红染色30 s，冲洗5 min；乙醇梯度脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察。

1.5血脂及胰岛素抵抗相关指标 在处死大鼠前12 h禁食，收集大鼠眼底静脉血进行检测。采用比色法测定血脂指标，检测项目包括：血清三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)。利用公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、β细胞功能指数(HOMA-β)、新β细胞功能指数(MBCI)。

1.6RT-PCR检测NLRP3 mRNA、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)1 mRNA表达 处死小鼠后，解剖胰腺及肝脏组织。采用Trace试剂盒，提取mRNA，洗脱后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA完整性。95℃预变性3 min，95℃ 30 s，退火温度40 s，72℃ 30 s，40个循环，设置荧光反应在每个扩增周期后80℃ 10 s的条件下进行，最后72℃持续5 min。NLRP3上游引物：5′-TTCCATTTGTAGGCCAACGGG C-3′，下游：5′-CTGTCCGCATGTCAGCATACGT-3′;caspase1上游引物：5′-GCCACGGTGGTGAAAC AGTA-3′，下游：5′-AGCCTTGGTTCGAAACATCG-3′;β-actin上游引物：5′-GTGTTGGCGTACAGGTC TTTG-3′，下游：5′-CGTACCACTGGCATCGTG AT-3′。

1.7统计学方法 采用SPSS20.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组骨丢失量及剩余量比较 造模后8 w，与对照组及肥胖组比较，模型组与治疗组的骨丢失量显著升高，骨剩余量显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组骨丢失量及剩余量比较

2.2牙周组织HE染色 HE染色显示，正常组牙周组织结构完好，结合上皮附着紧密，牙槽嵴顶完整，无牙槽骨吸收。造模组牙周组织结构破坏明显，结合上皮根向迁移，大量炎细胞浸润，牙槽嵴顶显著吸收，表现为慢性牙周炎，见图1。

图1 正常组和造模组牙周组织(HE染色，×400)

2.3各组血脂相关指标水平比较 模型组TG、TC、LDL-C水平显著高于对照组，HDL-C水平显著低于对照组(P<0.05)；治疗组TG、LDL-C水平显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

2.4各组胰岛素抵抗相关指标水平比较 与对照组和肥胖组比较，模型组HOMA-IR水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组HOMA-IR水平显著降低(P<0.05)；4组口服葡萄糖耐量试验(OGTT)曲线下面积比较：模型组>治疗组>肥胖组>对照组(P<0.05)；对照组MBCI、HOMA-β水平显著高于其他3组，且模型组MBCI、HOMA-β水平均显著低于肥胖组，治疗组MBCI、HOMA-β水平均显著高于模型组(P<0.05)。见表3。

表2 各组血脂相关指标水平比较

2.5各组胰腺NLRP3、caspase1 mRNA检测 胰腺NLRP3、caspase1 mRNA水平比较：模型组>肥胖组>对照组，且治疗组NLRP3、caspase1 mRNA水平显著低于模型组(P<0.05)。见表3。

2.6各组肝脏NLRP3、caspase1 mRNA检测 模型组肝脏NLRP3、caspase1 mRNA水平显著高于对照组和肥胖组，且治疗组NLRP3、caspase1 mRNA水平显著低于模型组(P<0.05)。见表4。

表3 各组胰岛素抵抗相关指标及胰腺NLRP3、caspase1 mRNA相对表达量水平比较

表4 各组肝脏NLRP3、caspase1 mRNA相对表达量

3 讨 论

胰岛素抵抗贯穿2型糖尿病(T2DM)整个病程，有研究提出胰岛素抵抗是T2DM诱因，与肥胖密切相关。肥胖使机体陷入慢性炎症，最终导致外周组织发生胰岛素抵抗现象〔11～13〕。肥胖组织有大量巨噬细胞浸润〔14〕。脂肪相关巨噬细胞(ATMs)，尤其是CD11阳性的ATMs，产生大量促炎因子最终导致胰岛素抵抗〔15〕。Deepti等〔16〕研究发现，胰岛素抵抗可用于预测人群中牙龈或牙周炎症发生风险，这可能与口腔致病细菌定植相关，这类致病菌可由口腔进入体内，进而引发心脏病、T2DM和消化道疾病。本研究结果表明模型组及治疗组发生明显的骨吸收，但在发生骨吸收的同时也存在一定的结构改建，出现了大量炎细胞浸润，说明本研究构建的模型符合慢性牙周炎的慢性炎性状态。本研究表明牙周基础治疗对缓解牙周炎大鼠的胰岛素抵抗状态有一定的效果，研究结论与柴巧学等〔17〕研究结论一致。NLRP3炎性小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和caspase1所组成〔18〕。NLRP3炎性小体能被病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)激活，当NLRP3被异常激活后，可大量招募caspase1，成熟的caspase1通过剪切IL-1β与IL-18的前体形式，使其成熟并分泌到细胞外，参与机体炎性反应和天然免疫应答〔19〕。研究表明T2DM患者体内NLRP3相关信号通路的异常激活与胰岛素抵抗有密切联系〔20，21〕。本研究结果表明模型组胰腺及肝脏组织内，出现了NLRP信号通路相关分子的异常活化，但在接受牙周基础治疗后，相关信号分子的活化程度有所下降。此研究结果与研究〔20，21〕结论一致。陈一丁〔20〕研究表明老年T2DM患者外周血NLRP3炎性小体的表达水平升高，且与患者的血糖控制水平和胰岛素抵抗呈正相关关系。白桂荣等〔21〕同样也得出类似研究，其研究结论表明NLRP3在T2DM人群中表达增加，并且随着血糖逐步增高，其胰岛素抵抗也逐渐加重。