王玲 王袁 黄超 张敏 张盼盼 喻昌利

(1华北理工大学附属医院呼吸科，河北 唐山 063000；2秦皇岛市第一医院呼吸科)

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是由于夜间睡眠过程中频繁发生上呼吸道部分(低通气)或完全(呼吸暂停)阻塞所致的一种以扰乱正常肺换气和睡眠结构为主的慢性呼吸障碍性疾病〔1〕。OSAHS因长期慢性间歇性缺氧可导致多器官多系统损伤，其中以脑功能受损较为显著，主要表现为认知功能障碍〔2〕。依达拉奉不仅可抑制神经元延迟死亡和脂质过氧化物的产生，还可保护运动神经元免受自由基和氧化应激损伤，以达到改善神经功能的作用〔3〕。细胞凋亡是调节细胞死亡的主要机制，与缺氧引起的细胞死亡密切相关〔4〕。凋亡肽酶激活因子(Apaf)-1 及存活素(Survivin)是与凋亡密切相关的相关因子〔5〕。目前，关于依达拉奉对认知功能的影响已有报道，但对间歇低氧损伤后凋亡相关蛋白Apaf-1、Survivin表达的影响鲜有报道。本文通过观察依达拉奉对OSAHS 患者Apaf-1、Survivin蛋白表达水平的影响，探讨依达拉奉改善认知功能障碍的可能机制。

1 材料与方法

1.1主要仪器、试剂 Apaf-1及Survivin兔抗鼠多克隆抗体、IgG羊抗兔单克隆抗体购自上海恒远生物科技有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒及PV6001试剂盒购自三鹰生物技术有限公司；低氧箱及氮气、氧气购自唐山市友谊公司。

1.2实验动物及分组 72只SPF级Wistar雄性大鼠〔体重(180±10)g〕，动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。采用随机数字表法分为对照组、5%间歇低氧(IH)组、依达拉奉组，每组24只，每组又分为10、21、28 d 3个时间亚组，每个时间亚组8只大鼠。

1.3动物模型的制备 制备间歇低氧大鼠动物模型。间歇低氧组大鼠低氧箱内首先注入30 s的氮气，流速压力为0.15 MPa，使低氧箱内最低氧浓度达5%，接下来注入40 s的压缩空气，流速压力为0.8 MPa，使氧浓度升至21%，继续注入50 s流速压力不变的压缩空气，使氧浓度维持在21%。上述120 s为1个周期，反复进行循环。依达拉奉组大鼠于间歇低氧实验前30 min尾静脉注入依达拉奉(3 mg/kg)。对照组大鼠的是实验箱持续注入压缩空气，流速为3 L/min，控制实验箱内氧浓度为21%。3组实验大鼠每日进行实验8 h，持续进行10、21、28 d。

1.4免疫组化检测Apaf-1及Survivin蛋白表达 固定后的大鼠，脑组织经二甲苯透明、切片等制备免疫组织切片。按PV两步法操作步骤，将准备好的切片进行滴加一抗(Apaf-1兔抗大鼠抗体 1∶500稀释、Survivin兔抗大鼠抗体1∶500稀释)、滴加二抗等步骤，最后应用DAB显色试剂盒进行显色，封片后显微镜下摄片。

1.5Morris水迷宫实验 每只大鼠于实验设计的时间点进行测试，晨起进行穿越平台及逃避潜伏期的训练，训练结束后进行上述实验的测试，每只大鼠每天上下午各进行测试6次，记录大鼠的逃避潜伏期时间及穿越目标象限的时间，取平均值。

1.6统计学方法 采用SPSS20.0软件进行独立样本t检验和重复测量方差分析。

2 结 果

2.1免疫组化检测Apaf-1及Survivin蛋白表达 光学显微镜下显示，对照组各个时间点Apaf-1及Survivin蛋白表达较少；与对照组比较，5%IH组及依达拉奉组各个时间点Apaf-1、Survivin蛋白的表达明显增多(P<0.05)；与5%IH组比较，依达拉奉组各个时间点Apaf-1蛋白表达均明显减少，Survivin蛋白表达均明显增加(均P<0.05)，见表1，图1，图2。

表1 3组不同时间点Apaf-1表达比较

图1 光学显微镜下观察两组Apaf-1蛋白表达(免疫组化，×400)

图2 光学显微镜下观察两组Survivin蛋白表达(免疫组化，×400)

2.2Morris水迷宫实验

2.2.1定位航行实验 对照组各个时间点逃避潜伏期无明显差异(均P>0.05)；与对照组比较，5%IH组及依达拉奉组各时间点逃避潜伏期明显延长(均P<0.05)；与5%IH组比较，依达拉奉组各时间点逃避潜伏期明显缩短(均P<0.05)，见表2。

2.2.2空间探索实验 对照组各个时间点跨越目标象限时间无明显差异(均P>0.05)；与对照组比较，5%IH组及依达拉奉组各时间点目标象限跨越时间明显缩短(均P<0.05)；与5%IH组比较，依达拉奉组各时间点目标象限跨越时间明显延长(均P<0.05)，见表2。

表2 3组不同时间点逃避潜伏期及跨越目标象限时间比较

3 讨 论

随着人们生活水平的提高，肥胖、糖尿病等疾病高发，OSAHS患病率呈升高趋势，是呼吸系统常见病。OSAHS可引起神经系统损害，如认知功能下降，严重影响人们的生活及工作〔6〕。依达拉奉作为神经内科重要的脑保护药物，临床已广泛应用。研究证实，依达拉奉可通过抑制炎症反应、氧化应激等减轻神经系统损伤进而改善认知功能〔7〕。本研究结果说明，间歇低氧损伤造成了大鼠认知功能下降，应用依达拉奉干预后，认知功能得到改善。

Apaf-1在凋亡调节中起关键作用，Apaf-1与细胞色素c和dATP结合后组成一个低聚凋亡小体，负责自动催化活化pro-caspase-9(Apaf-3)，进而激活caspase-3和细胞凋亡〔8〕。Survivin属于凋亡抑制因子(IAPs)基因家族中分子量最小但抑制凋亡能力最强的一员，其被BIRC5基因编码，可参与控制有丝分裂、调节细胞凋亡和细胞应激反应3个细胞过程〔9〕。研究报道，缺氧性脑损伤通过诱导大鼠脑组织Apaf-1表达，导致神经元凋亡增加〔10〕。有研究也证实了间歇低氧可引起Survivin表达的增加，可能抑制了神经元的凋亡〔11〕。本实验结果提示，间歇低氧促进了Apaf-1、Survivin蛋白的表达，加用依达拉奉干预后，使促凋亡因子Apaf-1的表达下降，抑制凋亡因子Survivin蛋白的表达增加，进而改善了认知功能。这与既往研究证实依达拉奉通过减少脑损伤后神经细胞的凋亡进而发挥脑保护作用一致〔12〕。

综上，依达拉奉可通过调节凋亡因子Apaf-1、Survivin蛋白表达的水平，进而改善间歇低氧损伤后大鼠的认知功能。