李莉英 方立 苑聪 张银妆 邹斌 熊巍

(长沙市第一医院心内二科，湖南 长沙 410005)

急性心肌梗死(AMI)是一种严重的心脏疾病，手术治疗是主要的治疗方式，能够重新建立血供，但对损伤的心肌细胞无修复作用〔1,2〕。有研究表明〔3〕，内皮细胞间充质转化(EndMT)促进了AMI后的心肌纤维化，而提高AMI后的自噬水平，可抑制EndMT，减轻心肌纤维化，改善心功能。内皮祖细胞(EPCs)是一种骨髓的干细胞亚群，其与血管新生密切相关。有研究表明，EPCs在重建血供、促进血管新生和缓解内皮细胞障碍中发挥着重要作用〔4〕。在AMI治疗中，其能有效促进血管重建，改善心功能，本研究探讨自体EPCs移植对AMI的干预及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取SPF级40只SD健康大鼠，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，鼠龄(3.9±0.3)个月，体重(227.7±10.8)g。所有大鼠养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间1 w。本实验均获得医院伦理委员会批准。主要试剂：内皮素(ET)-1、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)、一氧化氮(NO)试剂盒(上海科敏生物科技有限公司)、人三型前胶原肽(PⅢP)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)兔抗大鼠肝细胞生长因子(HGF)抗体(上海振誉生物科技有限公司)、大鼠抗小鼠HGF受体原癌基因(c-Met)抗体(北京义翘神州科技有限公司)。

EPCs细胞分离和培养：在无菌条件下，取3 ml的心脏血液，使用磷酸二氢盐缓冲液进行1倍稀释，置于淋巴细胞分离液之上，采用离心法对单个核细胞进行收集，进行洗涤2次，按照5×106个/孔与纤维连接蛋白包被的24孔培养板中，然后再加入20%的胎牛血清、30 μg/ml的血管内皮生长因子(VEGF)、100 U/ml青霉素及100 U/ml的链霉素的M199培养液，放置于37℃、5%CO2培养箱内进行培养，3 d后换液，除去未贴壁细胞，每3～4 d换液1次。

1.2方法

1.2.1分组、建模及给药 随机选取40只大鼠中10只为正常组，剩余30只大鼠均参照靳文学等〔5〕建立AMI大鼠模型，将大鼠进行麻醉，进行气管插管观察各大鼠心电图变化，对所有大鼠进行开胸，对左冠状动脉前降支近段进行结扎，当其颜色变暗，心脏变大，心肌运动明显减弱及心电图ST段抬高则表示模型建立成功，模型建立成功后，将30只大鼠随机分为模型组10只、阳性对照组10只、EPCs移植组10只。模型组不进行任何药物治疗，阳性对照组使用阿托伐他汀钙进行治疗，剂量20 mg/kg，与3 ml的生理盐水混合进行灌胃处理；EPCs移植组使用50 μl EPCs在心肌梗死区进行注射。

1.2.2样本采集 所有大鼠在给药8 w后，静脉采血后处死，以离心半径为5 cm、以转速3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，-80℃保存，待用。

1.2.3切片及染色 取心肌组织，在4%多聚甲醛进行固定、脱水透明，浸蜡包埋，脱蜡、苏木素-伊红(HE)染色，之后脱水、透明，切片厚度为4 μm，待封片晾干后显微镜下观察大鼠心肌组织病理表现。

1.2.4检测心功能指标水平 使用美国GE公司vivid7型彩色多普勒超声心动图仪检测室间隔厚度(IVSD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期容积(LVESV)、短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)。

1.2.5检测ET-1、NO、PⅢP水平 采用酶联免疫吸附对ET-1、NO、PⅢP水平。

1.2.6检测LDH、ALT、AST水平 使用酶标仪对LDH、ALT、AST水平进行检测。

1.2.7HGF/c-Met通路蛋白检测 Western印迹检测HGF、c-Met通路蛋白，提取大鼠肺组织中样品总蛋白，将其与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min后，进行电泳，并将蛋白电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%脱脂奶粉封闭1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(HGF、c-Met按照1∶1 000稀释)，在4℃条件下进行震荡过夜，再次洗涤，放入二抗溶液TBST(HGF、c-Met按照1∶5 000稀释)，室内震荡120 min后，洗涤，显色成像，使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验和方差分析。

2 结 果

2.1病理组织学观察 正常组心肌排列整齐，细胞核明显，染色均匀，未见肌纤维肥大、断裂；模型组心肌纤维损伤，排列不整齐，断裂明显，并可见较多坏死灶；阳性对照组明显改善心肌损伤，EPCs移植组改善心肌损伤最为明显。见图1。

图1 4组心肌组织病理形态学变化(HE，×200)

2.2各组IVSD、LVESD、LVESV、LVEDD、FS、EF比较 EPCs移植组、阳性对照组、模型组IVSD、FS、EF显著低于正常组，LVESD、LVESV、LVEDD显著高于正常组(P<0.05)；EPCs移植组、阳性对照组IVSD、FS、EF显著高于模型组，LVESD、LVESV、LVEDD显著低于模型组(P<0.05)；EPCs移植组IVSD、FS、EF显著高于阳性对照组，LVESD、LVESV、LVEDD显著低于阳性对照组(P<0.05)。见表1。

2.3各组ET-1、NO、PⅢP水平比较 EPCs移植组、阳性对照组、模型组ET-1、PⅢP水平显著高于正常组，NO水平显著低于正常组(P<0.05)；EPCs移植组、阳性对照组ET-1、PⅢP水平显著低于模型组，NO水平显著高于模型组(P<0.05)；EPCs移植组ET-1、PⅢP水平显著低于阳性对照组，NO水平显著高于阳性对照组(P<0.05)。见表2。

2.4各组LDH、ALT、AST水平比较 EPCs移植组、阳性对照组、模型组LDH、ALT、AST水平显著高于正常组(P<0.05)；EPCs移植组、阳性对照组LDH、ALT、AST水平显著低于模型组(P<0.05)；EPCs移植组LDH、ALT、AST水平显著低于阳性对照组(P<0.05)。见表2。

表1 各组IVSD、LVESD、LVESV、LVEDD、FS、EF比较

表2 各组ET-1、NO、PⅢP、LDH、ALT、AST水平比较

2.5各组HGF/c-Met通路蛋白表达量比较 EPCs移植组、阳性对照组、模型组HGF、c-Met蛋白表达量显著高于正常组(P<0.05)；EPCs移植组、阳性对照组HGF、c-Met蛋白表达量显著低于模型组(P<0.05)；EPCs移植组HGF、c-Met蛋白表达量显著低于阳性对照组(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组HGF/c-Met通路蛋白表达量比较

图2 Western印迹检测心肌组织中HGF/c-Met通路蛋白HGF、c-Met蛋白

3 讨 论

AMI是冠状动脉发生急性和持续性的一种缺血缺氧性心肌坏死。有研究表明，再灌注会增加心肌供血和供氧，但其会造成心肌的再次损伤〔6,7〕。唐一峰等〔8〕研究表明，通过使用高迁移率族蛋白(HMG)B1注射联合骨髓间充质干细胞(MSCs)移植的治疗方法可有效改善AMI预后。

EPCs主要源于骨髓和外周血中，有细胞分化功能，被广泛应用于心肌成形术中〔9,10〕。刘革铭等〔11〕研究表明，外周血EPCs移植可显著改善AMI大鼠心功能，EPCs移植同时予以丹参注射液优于单独应用EPCs移植，起到心肌修复的协同作用。EPCs细胞移植后，因环境较差，并不能长期生存，因此为其提供较好的生存环境已成为研究进一步突破的重点。黄磊等〔12〕研究表明，缓激肽预处理能明显促进EPCs增殖,降低细胞凋亡,缓激肽预适应EPCs移植能明显减少小鼠心肌梗死面积并促进心肌血管的新生，使心功能得到改善。本研究结果说明，EPCs移植能有效改善各组心功能水平，效果显著。

ET-1由内皮细胞释放，可收缩血管。PⅢP主要在心肌细胞中表达，被认为是能反映心肌纤维化的重要指标，而NO是由内皮细胞产生的输血管物质，能保护血管内皮。李景瑞等〔13〕研究表明，经皮冠状动脉介入(PCI)术前应用替罗非班可缓解临床症状，改善心功能，保护血管内皮，恢复冠状动脉血流灌注，但应注意其出血风险。张辉等〔14〕研究表明，瑞舒伐他汀可有效改善AMI患者PCI术后的血管内皮功能及炎性因子水平，提高疗效，从而改善患者的生活质量。本研究结果说明EPCs移植能有效降低各组ET-1、PⅢP水平，提高NO水平，效果显著。杨伟峰等〔15〕也认同此结果。

LDH、ALT、AST水平的测定能有效反映出AMI程度和对AMI的判定。当LDH、ALT、AST水平明显升高时，则表示心肌细胞处于变性坏死期，细胞明显受损〔16〕。本研究结果说明，EPCs移植能有效降低LDH、ALT、AST水平，减轻心肌细胞受损程度，效果显著。王建飞等〔17〕研究表明，H-FABP更利于AMI的超早期诊断，便于临床医生给患者提供更高效的治疗方案。佘灵芝等〔18〕研究表明，检测心肌组织S100A1、LDH和肌酸激酶同工酶(CK-MB)表达有助于AMI的判断。均与本研究结果一致。

HGF是间质细胞衍生的一种能促进细胞有丝分裂且具有多功能的因子，是由α链和β链组成的异二聚体，其受体为原癌基因c-Met，能够诱导c-Met受体酪氨酸磷酸化。HGF能改善高血压和相关动脉硬化及心力衰竭。HGF通路在心血管疾病中也发挥着重要作用。相关研究表明AMI患者体内HGF水平会大幅度上升，且与心肌重构有相关性〔19〕。本研究结果表明，EPCs移植能有效降低HGF、C-Met表达，效果显著。袁博等〔20〕也认同此结果。